Evolución de métodos de análisis
de genoma embrionario

Daniela Lorenzi

Introducción

Los avances en el campo de la biología molecular de las últimas décadas han impactado en la evolución de las estrategias metodológicas aplicadas en la detección de alteraciones cromosómicas en biopsias embrionarias. Este análisis está principalmente indicado para pacientes de edad reproductiva avanzada, fallas reiteradas de implantación, abortos recurrentes y factor masculino severo. Las alteraciones cromosómicas son causantes de pérdidas de embarazos, fallas de implantación y síndromes genéticos. Según Rubio et al. (2019), más de la mitad de los embriones generados en el laboratorio de embriología mediante tratamientos reproductivos presentan una anomalía cromosómica. Por lo tanto, es comprensible que exista una búsqueda constante para poder mejorar la exactitud de los estudios preimplantatorios, con el fin de seleccionar con mayor seguridad un embrión euploide/diploide para la transferencia, y contribuir finalmente al éxito del tratamiento reproductivo. Sin embargo, es fundamental entender que toda técnica molecular presenta sus propias limitaciones y fortalezas.

Primeros métodos aplicados en PGT

Los primeros estudios genéticos preimplantatorios para aneuploidías (PGT-A) se llevaron a cabo mediante la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH). (Munné et al., 1993). Se utilizaban sondas (fragmentos de ADN marcados con fluorocromos) complementarias a distintos segmentos cromosómicos. Mediante un microscopio de fluorescencia era posible el recuento de estos cromosomas en las células embrionarias. Sin embargo, este primer método presentaba múltiples limitaciones. Se estimaba una tasa considerable de falsos negativos debido a que solo se analizaba un número limitado de cromosomas (generalmente entre 9 a 12), y la sonda sólo confirmaba la presencia o ausencia de la región cromosómica para la cual había sido diseñada, sin poder determinar esto en la totalidad del cromosoma. Otras cuestiones técnicas implicaban fallas en la hibridación de la sonda o solapamiento de señales. Se estima que el 20% de los embriones anormales eran incorrectamente diagnosticados (Schoolcraft et al., 2010). Además, dado que este procedimiento se realizaba generalmente en blastómeras de embriones en su tercer día de desarrollo, donde la tasa de mosaicismo es mayor que en estadio de blastocisto, existía un riesgo mayor de falsos positivos (Chen et al., 2014; Seli et al., 2010).

La técnica que posteriormente revolucionó el área de la genética reproductiva fue el microarray-CGH (Hibridación Genómica Comparada). En este procedimiento, el ADN embrionario marcado con un fluorocromo específico competía contra un ADN de referencia, marcado con otro tipo de fluorocromo, por hibridar con sondas genómicas de secuencias conocidas, las cuales estaban inmovilizadas sobre un chip de array. Las ganancias y pérdidas de material genético en la muestra embrionaria se detectaban mediante un software de análisis que interpretaba la intensidad de la fluorescencia generada para cada región cromosómica (Seli et al., 2010). La principal ventaja de este abordaje fue la capacidad de evaluar de manera completa los 24 cromosomas (22 autosomas y 2 sexuales X/Y), a pesar de ser una técnica muy laboriosa.

Con los avances en las técnicas de vitrificación, se comenzó gradualmente a aplicar estos estudios en embriones en estadio de blastocisto. Los avances en el laboratorio de embriología han facilitado la adopción de esta nueva técnica molecular de microarray-CGH y de otras posteriores, al permitir la vitrificación de los blastocistos biopsiados, a la espera del resultado del PGT (Fiorentino, 2012; Scott et al., 2012).

PGT por NGS para la detección del número de copias de los cromosomas

En la actualidad, el método molecular más ampliamente utilizado es la Secuenciación de Nueva Generación (NGS, por sus siglas en inglés Next Generation Sequencing). El PGT-A por NGS permite la cuantificación del número de copias de los 24 cromosomas. Inicialmente, se parte de una baja concentración de ADN obtenida de la biopsia de 5 a 10 células de trofoectodermo. Por lo tanto, el primer paso implica una amplificación del genoma completo, lo que aumenta la cantidad de ADN embrionario disponible para el posterior análisis. Para esta amplificación, existen diferentes kits comerciales disponibles que permiten un rápido procesamiento (Treff & Zimmerma, 2017).

Los fragmentos de ADN de cada embrión se marcan con una secuencia única (un código de barras), que facilitará su identificación posterior durante el análisis bioinformático. Este proceso de codificación permite el análisis en simultáneo de 24 o 96 muestras en una única secuenciación, dependiendo de la plataforma utilizada, optimizando el tiempo y los costos del análisis (Fiorentino et al., 2014; García-Pascual et al., 2020; Rubio et al., 2019). La secuenciación realizada mediante este abordaje es una secuenciación de baja cobertura (profundidad menor al 0,1%). El análisis bioinformático implica: 1) La alineación de las lecturas generadas de cada cromosoma durante la secuenciación con un genoma humano de referencia para su identificación. 2) La determinación del valor del número de copias para cada cromosoma, comparando las diferencias relativas dentro de la misma muestra para la detección de desbalances cromosómicos mediante la aplicación de un software específico (Fiorentino et. al., 2014; Kung et. al., 2015; Treff & Zimmerman, 2017).

El PGT-A por NGS ha demostrado numerosas ventajas técnicas. El NGS es una tecnología de mayor rendimiento y presenta una mejor resolución al ofrecer un rango dinámico más amplio que el array-CGH. Esto facilita, por ejemplo, la detección del nivel del mosaicismo cromosómico. Además, es posible acoplar procesos automatizados en determinadas etapas del procesamiento de la muestra para NGS y análisis de datos. Esto permite disminuir el riesgo de errores técnicos y humanos, así como el riesgo de contaminaciones, lo que aumenta la solidez y reproducibilidad de los resultados (García-Pascual et al., 2020).

Nuevos avances en PGT-A: más allá de las aneuploidías

A pesar de las ventajas aportadas por la metodología de NGS, aún persisten ciertos desafíos. Una de las principales limitaciones radica en la incapacidad para detectar niveles de ploidía, es decir, anomalías numéricas que involucren a la totalidad del conjunto de cromosomas.

Cuando todos los cromosomas se encuentran alterados de la misma manera, el resultado del número de copias por NGS se normaliza. En consecuencia, embriones con una haploidía uniforme (23 cromosomas) o una triploidía uniforme (69 cromosomas) pueden ser incorrectamente clasificados como diploides (46 cromosomas). Esto conlleva implicancias clínicas relevantes ya que la transferencia de embriones con un nivel de ploidía alterado puede resultar en fallas de implantación, pérdidas gestacionales o embarazos molares (Caroselli et al., 2023). Se estima que hasta el 10% de las pérdidas gestacionales espontáneas son a causa de una triploidía (Levy et al., 2014). Por consiguiente, los recientes avances en las estrategias aplicadas al PGT han buscado resolver esta principal limitación.

De manera rutinaria, el embriólogo verifica la fecundación en el día uno de desarrollo embrionario mediante la visualización de los dos pronúcleos (PN), como marcador para predecir la ploidía. Los cigotos con 2PN tendrían mayor probabilidad de ser diploides que los que presentan un número anormal de PN. Las guías estandarizadas no avalan la transferencia ni criopreservación de embriones derivados de ovocitos ≥ 3PN. Tampoco se recomienda la transferencia de embriones provenientes de cigotos 1PN o 0PN (de Los Santos et al., 2016). Sin embargo, existen reportes de que la relación entre la ploidía y la evaluación morfológica estandarizada para la visualización de PN no es totalmente directa (Lim et al., 2000). Hasta el 10% de los ovocitos inseminados pueden llegar a presentar una fertilización anormal y suelen ser descartados en ausencia de una metodología fiable que confirme su estado real de ploidía (Capalbo et. al, 2017).

La nueva propuesta innovadora permite la integración de distintas estrategias moleculares que en conjunto puedan proporcionar información invaluable sobre la constitución genética del embrión. Se realiza una secuenciación adicional de mayor profundidad y dirigida hacia la detección de polimorfismos de nucleótido único (SNPs), complementando la información proporcionada por el análisis por NGS que determina el número de copias de los cromosomas (Caroselli et al., 2023).

Los SNPs son variaciones que afectan a un único nucleótido del genoma. Las personas comparten el 99,9% de su material genético. El 0,1% de variabilidad genética se atribuye en parte a los SNPs. Debido a esto, los SNPs pueden emplearse como una “huella genética” para la identificación de individuos (Torrades, 2002). Los paneles de secuenciación para la detección de SNPs son cuidadosamente diseñados mediante la selección de SNPs bialélicos con una alta frecuencia alélica. Esto significa que su alelo alternativo debe observarse con una alta frecuencia en la población general. Analizando la distribución de las fracciones alélicas de los SNPs a lo largo del genoma de una muestra embrionaria, podemos determinar su estado real de ploidía (Cagnin et al., 2023; Caroselli et al., 2023; Marin et al., 2018). Otras plataformas basadas en arrays de SNPs han posibilitado también la detección de ploidías, aunque en general han sido sustituidas por el NGS dado las ventajas previamente presentadas (Marin et al., 2018).

Ya se han publicado resultados sobre la aplicación de este nuevo tipo de metodologías. En un estudio reciente realizado por Girardi et al. (2023), se analizaron un total de 318 embriones con fertilización anormal. A los 133 embriones que resultaron euploides (41,88%) por el procesamiento convencional por NGS, se procesaron posteriormente con el nuevo panel de secuenciación para SNPs. Se confirmó finalmente la diploidía en el 35,6% de los embriones 1PN y en el 33,3% de los embriones >2PN. Los investigadores concluyen que esté análisis permitió el uso clínico de 72 embriones euploides/diploides, que de otro modo no hubieran sido considerados para la transferencia por presentar inicialmente una fecundación anormal.

Por último, los algoritmos bioinformáticos aplicados al análisis de SNPs ofrecen ventajas adicionales. En primer lugar, permiten identificar la presencia de un ADN contaminante (ya sea de un individuo externo o de ADN materno) en una muestra de biopsia embrionaria (Marin et al., 2018). Esto es especialmente relevante ya que una contaminación podría potencialmente enmascarar el resultado del embrión y conducir a un diagnóstico erróneo (falso negativo o error en el diagnóstico del sexo del embrión). En segundo lugar, algunos laboratorios han validado estos algoritmos para el análisis de parentesco entre los embriones. En casos donde se tienen al menos dos embriones diploides, es posible confirmar que estos embriones están genéticamente relacionados entre sí, es decir, que comparten los mismos progenitores. Toda esta información adicional ofrecida por el análisis de SNPs puede utilizarse como un control de calidad de todo el procesamiento de la muestra para PGT-A.

PGT-A e inteligencia artificial

Como en diversos ámbitos científicos, la inteligencia artificial (IA) ha avanzado sobre la medicina reproductiva. En los últimos años, los laboratorios de genética reproductiva han mejorado su capacidad diagnóstica en el estudio preimplantacional de embriones, mediante algoritmos bioinformáticos propios que utilizan IA y el machine learning.

Los laboratorios más especializados han desarrollado nuevos algoritmos de diagnóstico a partir de los datos recopilados del análisis previo de miles de muestras de biopsias embrionarias. De esta manera, la IA ha posibilitado la automatización de los análisis, permitiendo un diagnóstico más preciso y exacto, reduciendo gradualmente el factor asociado a la subjetividad humana en la visualización e interpretación de los perfiles de secuenciación por parte de los operadores especializados.

Además, estos algoritmos, gracias al machine learning, tienen la capacidad de redefinir los parámetros y mejorar continuamente al aumentar el número de análisis realizados. Por lo tanto, la IA tiene el gran potencial de mejorar los resultados clínicos del PGT-A al tener cada vez mayor exactitud en la discriminación de embriones euploides de los aneuploides, embriones mosaicos, o con niveles anormales de ploidía (Buldo-Licciardi et al., 2023; García-Pascual et al., 2020).

En un estudio reciente, se ha demostrado de manera retrospectiva una mejora significativa en la tasa de embarazo en curso y/o nacido vivo con la aplicación de un algoritmo bioinformático basado en inteligencia artificial (70,3% vs. 61,7%, p-valor=0,049) (Buldo-Licciardi et al., 2023). Sin embargo, aún se requieren trabajos prospectivos randomizados para confirmar la mejoría en los resultados con la IA.

Conclusión

En resumen, el enfoque más completo hasta la fecha en PGT implica la integración de diversas estrategias. Los métodos por NGS permiten la evaluación simultánea del número de copias de cada cromosoma para detectar aneuploidías, así como la evaluación de SNPs para poder discriminar diferentes niveles de ploidía. Además, como control de calidad permite detectar posibles contaminaciones y confirmar parentesco entre los embriones de una misma pareja. Estos avances van de la mano con la mejora continua de los algoritmos de diagnóstico bioinformáticos gracias a la aplicación de la inteligencia artificial y el machine learning. La evolución de los métodos de análisis genético busca tener un impacto positivo en la práctica clínica, mejorando la exactitud del PGT-A, permitiendo tener un mayor número de embriones euploides/diploides disponibles para la transferencia, disminuyendo el riesgo de fallas de implantación y pérdidas gestacionales.

Agradecimiento

A Taccyanna Mikulski Ali, Scientific Manager and Genetic Advisor South America, Igenomix, por su colaboración con la revisión del contenido de este capítulo.

Referencias

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