Descubriendo terra incognita

Alfredo D. Vitullo y Candela R. González^[1]

En su libro This is Biology, Ernst Mayr (1997) recorre elegantemente el desarrollo de las principales áreas de la biología a partir de mediados del siglo xix y a lo largo del siglo xx. Así, nos introduce en la evolución, la genética, la embriología y la ecología: en sus inicios, sus teorías, sus perspectivas particulares al interpretar el mundo biológico. Estas grandes áreas conceptuales de la biología se desarrollan de manera independiente unas de otras a lo largo de la mayor parte del siglo xx.

Sin embargo, llegando al final del milenio y desafiando el quinto postulado de Euclides, esas paralelas comenzaron una convergencia hacia un punto impropio en el infinito, que dio lugar a una conjunción interpretativa que conocemos hoy como la biología evolutiva del desarrollo (EVO-DEVO), o, en forma más amplia, como la biología ecológica y evolutiva del desarrollo (ECO-EVO-DEVO).

Sobre estos desarrollos paralelos que se proyectan hacia ese punto en el infinito, planea un “επ”, la epigénesis o epigenética, que sobrevuela el ambiente interno del individuo regulado por su ADN, lo comunica con el ambiente externo y genera respuestas diferenciales sin alterar la secuencia de su genoma.

La metáfora de Waddington

El biólogo del desarrollo Conrad Hal Waddington fue, quizás, uno de los primeros en reconocer la necesidad de integrar la genética, la embriología, la evolución y el ambiente para poder comprender la complejidad del mundo biológico y observarlo como un sistema interactivo. En su interés por comprender esa complejidad, Waddington sostenía que la teoría sintética de la evolución, que conjuga la genética y los mecanismos evolutivos, erraba al no contemplar la importancia de la biología del desarrollo. El desarrollo ontogenético no es una simple recapitulación de la filogenia^[2]; por el contrario, esa recapitulación de diferentes momentos de la historia evolutiva que puede observarse al comparar el desarrollo embriológico entre diferentes grupos de animales pone de manifiesto la interrelación y participación directa de los mecanismos embriológicos y del proceso de desarrollo con la genética, la evolución y aun con el ambiente en que estos ocurren.

Esta interpretación integradora nos llega hasta el día de hoy como la “metáfora de Waddington”. En ella, Waddington nos presenta la creciente complejidad del desarrollo embriológico partiendo del momento en que se genera un nuevo genoma durante la fecundación –por la contribución genética aportada por el óvulo y el espermatozoide– para constituir una primera célula totipotente, el huevo o cigoto, que iniciará la compleja formación de un nuevo individuo. En esta metáfora visual, ese cigoto se encuentra en el punto más alto de una canaleta, a través de la cual irá descendiendo y tomando diferentes bifurcaciones o “canales” que el camino le presentará primariamente siguiendo el dictado de la información contenida en su genoma. A través de esta “canalización”, el desarrollo ocurre de manera ordenada, para dar como resultado un individuo con las características propias de su especie. A esta visión puramente regida por el dictado del genoma, Waddington le agrega la permanente interacción de las diferentes moléculas que se producen a medida que avanza el desarrollo; moléculas cuya interacción entre sí y, especialmente, sobre el propio genoma modifica o dirige, en muchos casos, la expresión génica. Así, introduce el concepto de “epigénesis” o “epigenética” y lo define como el conjunto de mecanismos y propiedades emergentes que dirigen el desarrollo de los organismos a través de la integración de la información contenida en su genoma y la información del ambiente en que ocurre el desarrollo, lo que da como resultado un individuo funcional (Waddington, 1942). Ese conjunto de moléculas y propiedades emergentes que planea sobre el genoma e incorpora la información endógena y exógena constituye el “epigenotipo” como una maquinaria interpretativa del genotipo (Duclos et al., 2019). El epigenotipo, como lo define conceptualmente Waddington, es una red de interacciones que sobrevuelan el territorio del genoma, cuyos mecanismos e interacciones ligan el genotipo al fenotipo emergente (Jamniczky et al., 2010).

De este modo, el epigenoma integra la información exógena, actúa sobre el genoma durante el desarrollo embriológico y continúa desplegándose en todos los procesos posteriores de desarrollo del individuo, incluida la formación de los gametos femenino y masculino que, al momento de unirse en la fecundación, darán lugar a un reinicio del desarrollo. Así, los procesos epigenéticos dirigen directamente las trayectorias del fenotipo en respuesta al estrés ambiental y las presiones selectivas. Los mecanismos epigenéticos están involucrados tanto en la generación de variaciones fenotípicas aun en ausencia de variaciones genéticas, como en la limitación de la variación fenotípica en presencia de variaciones genéticas o ambientales. Es decir, la epigenética facilita la formación de múltiples fenotipos a partir de un único genotipo en respuesta a variaciones ambientales, mecanismo que conocemos como “plasticidad” o “norma de reacción de un genotipo” desde la genética clásica. Pero también puede amortiguar los efectos de las variaciones ambientales conduciendo a la “canalización” de un determinado fenotipo, aun en presencia de variabilidad genética (Tronick y Hunter, 2016).

Las formas de la epigénesis

Desde la formulación conceptual original de la epigenética que realizó Waddington en 1942, se ha avanzado de manera importante y creciente en el reconocimiento de las moléculas y mecanismos moleculares involucrados en los procesos epigenéticos. Si bien el concepto original de “epigenética” es amplio e inclusivo, el avance en la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados permite, actualmente, agrupar a los procesos epigenéticos en tres categorías: epigenética obligada, facilitada y pura (O’Dea et al., 2016). La epigenética obligada comprende mecanismos que son propios a la dinámica de expresión del genoma sin influencia de factores ambientales; son marcas que se agregan o eliminan durante los procesos de diferenciación celular y participan en la morfogénesis y el desarrollo normal. La epigenética facilitada incluye modificaciones que dependen de factores genéticos con influencia de factores ambientales; actúan y dependen de una secuencia blanco del ADN a partir de la cual regulan la expresión génica en respuesta a señales ambientales. La epigenética pura comprende mecanismos no dependientes de la secuencia del ADN debidos a efectos solamente ambientales o estocásticos; este tipo de mecanismos epigenéticos promueve cambios adaptativos que eventualmente pueden constituirse en heredables.

El concepto original de “epigenética” ha sufrido reinterpretaciones de carácter funcional que hoy se aceptan de manera generalizada. De modo operativo, entendemos a la epigenética como el conjunto de efectos y mecanismos no codificados en la secuencia del ADN que actúan en la regulación de la expresión génica, incluyendo las interacciones entre genes y entre genes y sus productos. En este sentido, la epigenética es un sistema de marcación y regulación de la actividad génica, esencial para el desarrollo normal. Se trata de cambios transitorios o heredables en la función de los genes (expresión génica) que no promueven cambios en la secuencia del ADN, como sí lo hacen las mutaciones.

Entre los diferentes mecanismos epigenéticos hoy reconocidos, se incluyen cambios en la expresión de ARN no codificante (micro-ARN, miRNA) y ARN PIWI de interacción (piRNA), modificaciones postraduccionales (PTM) de las histonas y en la metilación del ADN (Jenkins y Carrell, 2012). Estas marcas epigenéticas en el ADN y las histonas servirán de diana para factores de transcripción y proteínas regulatorias, o afectarán la estructura del nucleosoma de manera de favorecer o inhibir la unión ADN-histonas, en cuanto pueden activar o inhibir a los promotores de genes específicos (Cortés-Mendoza et al., 2013; Biermann y Steger, 2007). Los patrones de metilación de la citosina en los dinucleótidos CpG cercanos a los promotores de ciertos genes son de suma importancia en la regulación de la expresión génica. Las PTM de las histonas son esenciales para una correcta función celular y la suma de estas modificaciones se conoce como “código de histonas” (Kouzarides, 2007). Estas marcas epigenéticas son específicas de cada gen y potencialmente heredables a la descendencia. Se encargan de señalizar de manera diferencial elementos regulatorios presentes en el ADN y regulan de forma dinámica la respuesta a señales exógenas (Kouzarides, 2007). Recientemente, se ha demostrado que las protaminas^[3], así como las histonas, poseen múltiples PTM cuya presencia sugiere la existencia de un “código de protaminas” similar al código de histonas.

El paradigma epigenético: la impronta genómica

A principios de la década de 1980, los laboratorios de Azim Surani (Cambridge, Reino Unido) y Davor Solter (Filadelfia, EE. UU.) dieron a conocer sus resultados sobre el desarrollo de embriones monoparentales de ratón: embriones con dos conjuntos haploides de cromosomas heredados exclusivamente de la hembra (ginogenones y partenogenones) o del macho (androgenones) (Surani et al., 1984; McGrath y Solter, 1984). En ambos casos, estos embriones monoparentales no lograban desarrollar a término al transferirlos a una hembra seudogestante. Esto mostraba claramente que, si bien los cromosomas heredados de la hembra y del macho son genéticamente equivalentes, no lo son desde el punto de vista funcional. Por lo tanto, el desarrollo a término requiere de la presencia de un genoma haploide de origen materno y uno de origen paterno. Los desarrollos posteriores mostraron que esto es así debido a un mecanismo denominado “impronta genómica” (genomic imprinting). Este actúa sobre los gametos femeninos y masculinos y les imprime marcas diferenciales en algunas regiones del genoma y genes que identifican el origen parental (materno o paterno) al momento de reunirse durante la fecundación. Estas marcas epigenéticas se manifiestan por la metilación diferencial de la citosina de los residuos CpG de esas regiones sujetas a impronta, y dependen de si la gameta se ha formado durante la oogénesis o la espermatogénesis. Así, esta capacidad de dar funcionalidades distintas a los genomas paterno y materno durante el desarrollo sin estar estas codificadas en el ADN se transformó en el paradigma de la regulación de la expresión génica por epigénesis. Posteriormente, como se indicó en el apartado anterior, se descubrirían otros mecanismos moleculares que pueden incidir sobre la herencia de características epigenéticas, más allá de la información contenida en el ADN, motivadas por el descubrimiento y la importancia de la impronta genómica.

La impronta genómica no solo se manifiesta y regula el correcto desarrollo del embrión; con el correr de los años, hemos aprendido que, tanto en el ratón como en los humanos, la impronta genómica regula procesos posnatales relacionados a la regulación del sistema nervioso, el comportamiento, el metabolismo y las adaptaciones fisiológicas (Cleaton et al., 2014). Más aún, muchas patologías del desarrollo y neurológicas, como los síndromes de Prader-Willi, de Angelman y de Beckwith-Wiedemann, entre otros, tienen su origen en alteraciones de las marcas epigenéticas del origen parental.

Amnesias y recuerdos de los genomas parentales

El establecimiento de las marcas epigenéticas que identificarán el origen parental de los genomas haploides reunidos en la fecundación ocurre durante la gametogénesis. El ovario y el testículo ofrecen ambientes muy distintos, tanto fisiológica como hormonalmente, que habilitan una marcación diferencial de las regiones y genes sujetos a la impronta parental. Estas marcas diferenciales de origen serán llevadas por el óvulo y el espermatozoide al nuevo embrión en el momento de la fecundación. Sin embargo, a medida que progrese el desarrollo previo a la implantación, ocurrirá una ola masiva de desmetilación del nuevo genoma recién formado que ocurrirá más rápidamente en el genoma paterno que en el materno. En el estadio de mórula, se comenzará a recuperar la metilación en niveles comparables en la totalidad del nuevo genoma, y llegará al momento de la implantación con sus marcas de origen recuperadas. Ocurrida la implantación, se establecerán en el embrión las dos grandes líneas del desarrollo; la línea somática, que dará lugar al desarrollo de tejidos y órganos y conservará sus marcas de origen materno y paterno, y la línea germinal, que dará lugar a la formación de los gametos. Las células germinales primordiales (CGP) se originarán en el epiblasto del embrión recién implantado, adquirirán capacidades de totipotencialidad y sufrirán un borrado masivo de todas sus marcas epigenéticas, así como el silenciamiento de los genes que permiten el desarrollo somático. Desde su lugar de origen, migrarán para alcanzar las crestas gonadales a mitad de gestación en el ratón y entre las 6 y 8 semanas de gestación en el humano. En ese momento, las gónadas bipotenciales (capaces de desarrollar como ovario o testículo) colonizadas por las CGP desarrollarán el tejido germinal propio del sexo genético del embrión, XX o XY, inducirán el desarrollo del sistema reproductor propio de cada sexo, y sufrirán una extensa reprogramación epigenética de la totalidad de su genoma. Esta reprogramación implica el borrado de toda la memoria epigenética, tanto de marcas de metilación como de acetilación de histonas y cambios conformacionales de la cromatina, para adquirir un nuevo epigenotipo regido por el sexo del embrión en formación (Eguizabal et al., 2016). Si bien este proceso previene la transmisión de mutaciones epigenéticas, no impide nuevas alteraciones en este sentido que, como veremos luego, estarán asociadas a los efectos parentales regidos por los estilos de vida de los individuos.

¿Intervención reproductiva, disrupción epigenética?

Al mismo tiempo que la impronta genómica, paradigma de la epigenética, se afianzaba, en la década de 1980, las técnicas de reproducción asistida comenzaban, a su vez y paralelamente, un gran desarrollo, promovido por el nacimiento de Louise Brown en 1978 mediante fecundación in vitro, en Inglaterra (Steptoe y Edwards, 1978). Estas tecnologías, en la búsqueda de establecer terapéuticas apropiadas para atender a la infertilidad de las parejas, crearían nuevos ambientes in vitro y saltarían pasos esenciales del proceso de fecundación natural. Cabe preguntarse, entonces, si esta intervención del proceso de fecundación promueve de algún modo cambios epigenéticos al enfrentar a los gametos y embriones recién formados a un ambiente simulado, pero desconocido.

Recientemente, hemos comenzado a aproximarnos a esta cuestión. Aunque la composición química de los medios de fecundación hoy utilizados se aproxima en buen grado a la composición de los fluidos del oviducto, donde ocurre la fecundación y el desarrollo previo a la implantación, el soporte in vitro no reproduce el diálogo que el epitelio del oviducto mantiene con el embrión en desarrollo. Así, los gametos, al momento de interactuar, y el embrión, que inicia su desarrollo, son enfrentados a un ambiente nuevo que podría alterar las marcas epigenéticas. De hecho, la incubación de embriones en los dos medios más comúnmente utilizados en reproducción asistida, HTF y G2, promueven diferentes perfiles de expresión génica en cada caso, con alteración de marcas epigenéticas (Kleijkers et al., 2015; Mantikou et al., 2016). Más aún, algunos desórdenes asociados a la impronta genómica como el síndrome de Beckwith-Wiedemann muestran una prevalencia poblacional aumentada en los individuos nacidos por reproducción asistida, comparados con la población general: 1 de 2 700 casos luego de FIV/ICSI versus 1 de 13 700 casos en la población general (Vermeiden y Bernardus, 2013).

Sin embargo, no disponemos hoy de metodologías adecuadas que nos permitan discernir si las alteraciones epigenéticas observadas son promovidas por el ambiente in vitro o si se deben a alteraciones que los gametos ya portaban en el momento de la fecundación por efectos parentales asociados al estilo de vida de los individuos, o a ambas situaciones. En lo que refiere a la posibilidad de alteraciones portadas por los gametos mismos, deben considerarse también los procesos de congelación y descongelación de gametos, su maduración in vitro y otros, previos a la realización de una FIV o ICSI, como potenciales inductores de estas alteraciones.

Más allá del genoma: hábitos y códigos extragenéticos

Los hábitos comprendidos en el estilo de vida, como la dieta, la actividad física, el consumo de drogas o alcohol, son bien conocidos por influenciar la predisposición a patologías como la diabetes, la enfermedad cardiovascular o el cáncer (Donkin y Barrès, 2018). El estilo de vida de una generación puede modificar el riesgo de padecer enfermedades en la generación siguiente a través de los llamados “efectos parentales” (Donkin y Barrès, 2018). Estos efectos son particularmente importantes durante la gestación y, en especial, durante el desarrollo de las células germinales, dado que controlan la reprogramación del genoma y una posible transmisión transgeneracional de caracteres adquiridos. El descubrimiento de que dichos efectos parentales pueden ocurrir a través de cambios no genéticos o epigenéticos en los gametos, los cuales son transmitidos de manera directa a la siguiente generación, desafía el dogma de la herencia mendeliana y genera un cambio de paradigma en las teorías de la evolución (Danchin et al., 2019).

En el género femenino, la mayoría de los estudios sobre efectos parentales se centran en la etapa de gestación. El uso de modelos animales como ratas, ratones y primates no humanos ha permitido identificar modificaciones epigenéticas producidas por estrés durante la gestación. El estrés gestacional altera el eje hipotalámico-pituitario-adrenal de la descendencia de manera que produce déficits cognitivos y trastornos del neurodesarrollo (Bale, 2014). En la mujer, la exposición a infecciones uterinas, hipoxia, inanición y otros factores de estrés materno se asocia al riesgo de esquizofrenia, alteraciones de la memoria y anormalidades estructurales del cerebro en la descendencia (Bale, 2014).

En el sexo masculino, el estilo de vida paterno y el estrés preapareamiento pueden impactar sobre la reprogramación de las células germinales. A diferencia de las hembras, los machos no interactúan directamente con su descendencia en gestación, por lo que transmiten información exclusivamente a través de sus células germinales. El estilo de vida paterno (dieta, estrés, drogas de abuso) induce cambios epigenéticos que modifican parámetros neuroconductuales y metabólicos que pueden preparar a la descendencia para enfrentar las condiciones ambientales (Rando, 2012; Yuan et al., 2016), pero podrían también aumentar la predisposición a ciertas patologías (Vassoler et al., 2013); particularmente, por la posible ocurrencia de transmisión paterna de alteraciones epigenéticas (Vassoler et al., 2013; González et al., 2015, 2018). La espermatogénesis se caracteriza por tener un programa epigenético que involucra múltiples reorganizaciones de la cromatina y una regulación transcripcional única requerida para las divisiones meióticas y la maduración de los espermatozoides. En particular, hasta el momento en que se produce la compactación del genoma paterno mediante el reemplazo de histonas por protaminas, se crea en la célula germinal masculina una ventana de vulnerabilidad a la reprogramación ambiental o epigenética (Bale, 2015). La administración de cocaína en roedores machos, por ejemplo, puede desencadenar modificaciones epigenéticas en la línea germinal, con aumento de las tasas de ansiedad y depresión y deterioros cognitivos (Vassoler et al., 2013; White et al., 2016; Wimmer et al., 2017). Esta transmisión paterna se debe en parte al reemplazo incompleto de histonas por protaminas y a la aparición de marcas epigenéticas específicas, observables tanto en las ratas tratadas con cocaína, como en su descendencia masculina (Vassoler et al., 2013). Por lo tanto, las PTM de histonas representan marcas epigenéticas potencialmente heredables a la descendencia (Rajender et al., 2011; Vassoler et al., 2013). Recientemente, en nuestro laboratorio, hemos encontrado que la administración de cocaína en ratones puede inducir una reprogramación epigenética de las células germinales masculinas mediante cambios en enzimas epigenéticas y PTM específicas de histonas que podrían desencadenar el silenciamiento de la expresión génica y alterar el evento de reemplazo de histonas a protaminas (González et al., 2020). La presencia de histonas y marcas específicas parecen indicar, a la vez, una memoria de la espermatogénesis y un plan a futuro para el programa embrionario (Carrel y Hammoud, 2010). Es decir que existirían instrucciones epigenéticas llevadas por los espermatozoides en la fecundación para una correcta regulación de la expresión génica en los futuros embriones. Por lo tanto, comprender que las células germinales masculinas son susceptibles a señales exógenas durante la exposición a distintos factores de estrés e identificar el tipo de marcas epigenéticas que podrían alterarse es crítico para la definición de los mecanismos subyacentes del riesgo de trastorno o enfermedad en la descendencia.

Conclusión

Han pasado más de 75 años desde la definición conceptual de la epigenética. En los últimos 40 años, se ha salido del marco conceptual para transformarse en un área en pleno desarrollo que incide en los grandes temas de la biología al develar mecanismos inexplicados por la genética clásica. Los avances de los últimos años han permitido conocer sus formas de expresión, los mecanismos moleculares subyacentes y reabrir los postulados de Lamarck sobre la herencia de los caracteres adquiridos. La vinculación de la epigénesis a los mecanismos reproductivos es el sello distintivo de su importancia e incidencia en el desarrollo de los individuos. Así como hemos aprendido a asistir la reproducción para superar las barreras de la infertilidad, la intervención de los mecanismos epigenéticos nos permitirá, quizás, superar aún mejor esas barreras, en la medida en que esta tierra deje de ser desconocida.

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