Natalia Lorena Rojas[1] y Julia Yamila Santillan[2]
¿Qué es el glifosato?
El glifosato (GP) [N-[(fosfonometil)-glicina)] es un herbicida –del tipo organofosforado (OP)– no selectivo, sistémico, de amplio espectro y posemergente utilizado en la práctica agrícola para el control de malezas (figura 1). Originalmente fue sintetizado en el año 1950, y comercializado a partir de 1974 bajo el nombre de Roundup®, por el grupo Monsanto (Martins-Gomes et al., 2022). Actualmente el GP y sus derivados se han convertido en los pesticidas más ampliamente utilizados a nivel global –en términos volumétricos–, cuya aplicación se estima alrededor del millón de toneladas por año (Elorza & CASAFE, 2020). Con la llegada de los cultivos genéticamente modificados para su resistencia, las dosis utilizadas –en aquellos países que permitieron su implementación– aumentaron significativamente. Este paquete tecnológico simplificó y redujo el costo del trabajo en el sector agrícola, principalmente al disminuir los cuidados de los cultivos y generar así mejores resultados en menor tiempo, en relación con los herbicidas aplicados anteriormente (Duke, 2018). Además de su uso en la actividad agrícola, su aplicación se ha extendido a otras áreas como la silvicultura, el cuidado de los espacios públicos y residenciales (jardinería) y el control de malezas acuáticas (Castro Berman et al., 2018).
Figura 1. Estructura química del glifosato [N-(fosfonometil)-glicina]
El mecanismo de acción del GP se basa en la inhibición competitiva de la enzima 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), la cual participa en la biosíntesis del ácido corísmico –en la vía del ácido shikímico–, un precursor de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano (Richmond, 2018). De este modo, se interrumpe el metabolismo vegetal al dificultar la síntesis proteica y la producción de ciertos compuestos necesarios para la promoción del crecimiento y desarrollo –tales como el ácido indol-3-acético y la plastoquinona–. La EPSPS se encuentra en plantas y ciertos microorganismos, pero no así en animales (Duke, 2020). Esto permitió pensar, inicialmente, en el GP como un herbicida seguro y conveniente respecto a los que estaban disponibles en el mercado hasta el momento de comenzar su comercialización. Sin embargo, surgieron grandes controversias en su uso y regulación a partir de los demostrados efectos en la salud humana, sanidad animal y en los ambientes en los que se distribuye.
El impacto que genera el uso de glifosato en la salud humana y el ambiente
Como se mencionó anteriormente, el GP se ha instalado como una herramienta fundamental para la producción de cultivos, debido a su efectividad y facilidad de aplicación. Sin embargo, existen numerosas evidencias sobre el efecto negativo que genera tanto en el ambiente (suelo, agua y aire) como en la salud humana (Rivas-Garcia et al., 2022). En 2015 la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer clasificó al GP como agente probablemente carcinógeno para los humanos (Grupo 2A) (Berry, 2020). Asimismo, un amplio espectro de enfermedades, desde dolencias agudas a enfermedades crónicas, como cáncer, trastornos reproductivos y disfunciones del sistema endocrino, ha sido relacionado con la exposición a GP (Mac Loughlin et al., 2018). Desde el punto de vista del medio ambiente, se han detectado residuos de GP en diferentes niveles del suelo que contaminan el agua y se acumulan en los ríos y lagos (Demonte et al., 2018). En particular, se detectaron restos de GP en suelos debido a su alta sorción, así como también en aguas superficiales de zonas agrícolas por escorrentía, exceso de pulverización directa y su deriva. A pesar de la baja movilidad del GP, este es capaz de migrar hacia los acuíferos, se lo ha encontrado en muestras de agua subterráneas. La presencia de este herbicida en aguas superficiales afecta a las especies de peces y anfibios que pueden absorber GP del agua contaminada a través de sus branquias y vías de alimentación. Otro foco de contaminación ambiental con estos OPs lo constituyen los envases vacíos de agroquímicos y su dispersión geográfica, ya que no todos los aplicadores realizan el triple lavado de envases de pesticidas establecido por la regulación vigente, y solo el 10 % de ellos están incluidos en programas formalmente regulados para garantizar la correcta disposición final (Butinof et al., 2017; Kazar Soydan et al., 2021). Por esta razón, tanto las aguas de lavado que no tienen un tratamiento adecuado para su destino final como los contenedores vacíos de agroquímicos que se queman, se entierran o se reutilizan aumentan la exposición y contaminación del suelo y del agua. Lo anteriormente expuesto resulta en efectos ecotoxicológicos sobre la flora y la fauna acuática, cambios en los niveles de minerales saludables en el agua y en la acidez del suelo, lo que produce inestabilidad en los ciclos naturales (Lajmanovich et al., 2023).
Glifosato en Argentina
Durante los últimos años, Argentina ha experimentado una notable expansión de las actividades agrícolas, que constituyen una de las principales actividades productivas del país. De acuerdo con los datos del último Censo Nacional Agropecuario (INDEC, 2021), las explotaciones agropecuarias ocupan una superficie total de 157 millones de hectáreas, de las que el 22 % corresponden a superficies implantadas con algún cultivo. En dichas zonas, el uso de pesticidas es intensivo ya que permiten proteger la producción, así como también sostener la rentabilidad y competitividad del sector (Bigley et al., 2013; Molpeceres, 2022). Actualmente, en nuestro país se utilizan más de 580 millones de litros de agroquímicos, siendo el GP el herbicida más utilizado (Butinof et al., 2017; Montoya et al., 2021). El GP se emplea en cultivos resistentes a herbicidas, principalmente de soja, maíz y algodón. Durante el período 2013-2014, la demanda de dicho compuesto fue de 182,5 millones de kg, valor que se incrementó a más del doble en el periodo 2017-2018 (Alonso et al., 2018). Este uso intensivo de GP ha llevado a su acumulación en el agua, el suelo y el aire en distintas zonas de Argentina, lo que conlleva a una preocupación considerando que el GP es uno de los pesticidas que producen mayor impacto ambiental (Butinof et al., 2017). En particular, se ha reportado que la región pampeana y el nordeste del país son las zonas más afectadas. En Buenos Aires, en una región de producción de soja transgénica, se han detectado niveles tóxicos de agroquímicos en los ríos causados por la acumulación de estos, como así también una absorción de plaguicidas por las raíces de plantas no-blanco (Aparicio et al., 2017; Bertrand et al., 2023; De Gerónimo et al., 2014). Además, este agroquímico se ha hallado en más del 80 % de las muestras de agua de lluvia obtenidas de la región pampeana de Argentina (Demonte et al., 2018). Por lo expuesto, es importante mencionar que la población en general está directamente expuesta a estos pesticidas por el consumo de agua y alimentos contaminados. En Argentina, dos tercios del territorio no tienen acceso al agua potable (7 millones de personas) y, en particular, una parte de la población de zonas rurales depende de métodos alternativos para proveerse de agua potable (Mas et al., 2020). Históricamente, dicha población se ha abastecido mediante presas alimentadas por aguas de escorrentía complementadas con aguas subterráneas. En estos entornos, la calidad de las aguas subterráneas suele ser de regular a mala y el agua de lluvia adquiere importancia para el abastecimiento de este recurso. Actualmente, el agua de lluvia se recoge de los tejados de las casas y de los edificios públicos, y se almacena en tanques construidos con este fin. Este sistema se promueve cada vez más como una forma sencilla para que los residentes rurales tengan acceso al agua potable, sin embargo, se ha demostrado la presencia de altas concentraciones de pesticidas en estos sistemas (Chawla et al., 2018; Demonte et al., 2018; Mas et al., 2020). En este marco, la remoción de pesticidas de aguas de consumo presenta especial interés.
Asimismo, la exposición directa a estos pesticidas está relacionada con el mal uso profesional, por ejemplo, la que sufre el trabajador rural en el desarrollo de sus actividades. También es importante mencionar las exposiciones casuales, que afectan a las personas de los pueblos aledaños a cultivos por aplicaciones mal realizadas. Por ejemplo, en una zona rural de producción de soja de Santa Fe, se determinó que el 80 % de los niños examinados llevaban residuos de químicos tóxicos en la sangre. Esta intoxicación se atribuyó a la falta de agua corriente y al uso de agua contaminada para bañarse, para beber y para lavar la ropa. Finalmente, en esta categoría también se incluye a la población en general, que puede estar expuesta a través de residuos de plaguicidas que quedan en los alimentos –en frutas y verduras se han detectado plaguicidas por encima de los límites máximos permitidos (LMR) (Mac Loughlin et al., 2018)– o por la contaminación del agua, del aire o del suelo (Guerra et al., 2006; Kazar Soydan et al., 2021). Esta situación plantea la necesidad de que el nivel de estos contaminantes sea detectado y monitoreado frecuentemente en los alimentos, el agua y el ambiente, para el diagnóstico y la selección de estrategias para su remediación.
Procesos de remediación de aguas contaminadas con glifosato
Se han propuesto diferentes metodologías para el tratamiento de aguas residuales que contienen GP. Si bien las técnicas convencionales utilizadas para la eliminación de pesticidas pueden ser efectivas, también están asociadas con problemáticas como su complejidad, costo y la generación de nuevos desechos tóxicos. Entre ellas se puede mencionar la adsorción y los procesos de oxidación avanzada (POA). Alternativamente, durante las últimas décadas, se desarrollaron tratamientos biológicos o procesos de biorremediación para mitigar los efectos de este pesticida sobre el ambiente (figura 2). A continuación se describirán sucintamente las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
Figura 2. Estrategias de remediación de sistemas contaminados con Glifosato
Procesos de adsorción
Durante el proceso de adsorción, el contaminante soluble en agua es capturado/retenido en la superficie de un sólido. Este proceso suele utilizarse ampliamente y a gran escala para el tratamiento de aguas residuales debido a su diseño simple, el uso de adsorbentes no tóxicos, su bajo costo (dependiendo la matriz empleada) y su alta eficiencia. Es por ello que se ha evaluado el uso de esta estrategia para la eliminación de GP de aguas empleando diferentes materiales adsorbentes (Feng et al., 2020). Entre ellos, se estudiaron diferentes arcillas, como por ejemplo las hidrotalcitas y los hidróxidos doblemente estratificados, aunque dieron como resultado procesos ineficaces ya que existe una competencia por los sitios de adsorción entre el GP y los aniones presentes en el agua como el Cl- (Li et al., 2005; Sanchez Martín et al., 1999). El carbón activado es también un material aplicado frecuentemente para la purificación de aguas residuales por adsorción debido a su estructura microporosa, elevada superficie y eficiencia. Sin embargo, el costo de este material es una limitación para su aplicación en la remoción de GP de aguas industriales. En este sentido, a fin de disminuir el costo de este proceso, se comenzó a utilizar carbón activado derivado de residuos, lo que resultó en rendimientos mejorados –adsorción de GP de 52 mg g-1 d-1 (Mohsen Nourouzi et al., 2010). De forma similar, se ha testeado el uso de biocarbón considerando su bajo costo y su estructura altamente porosa, lo que contribuye a una elevada eficiencia de retención del GP. Los mejores resultados alcanzados fueron los obtenidos por Jia et al. (2020), quienes ensayaron un biocarbón modificado con nanopartículas de CuFe2O4, lo que permitió una máxima absorción de 269 mg g-1. Alternativamente, diferentes resinas (hidroxido de hierro III, D301 o D151 cargada con Fe+3) se utilizaron como material adsorbente de GP ya que presentan mayor afinidad por el herbicida en comparación a otros materiales, presentando una capacidad máxima de adsorción de 833 mg g-1 (F. Chen et al., 2016). Sin embargo, debido a la baja selectividad de la resina cuando coexisten sales inorgánicas con GP, su aplicación en el tratamiento de aguas residuales es limitada. Finalmente, se ha propuesto el uso de algunos biopolímeros como la quitina y el quitosano, que son materiales económicos y “verdes” pero con menor capacidad de adsorción en comparación con los anteriormente mencionados.
En síntesis, si bien la adsorción es un método relativamente simple y fácil de operar para la retención del GP y, en consecuencia, su remoción del agua, presenta ciertos inconvenientes que limitan su aplicación en aguas residuales de la agroindustria. Esto se debe a que uno de los requisitos para su aplicación es que el agua se encuentre en condiciones ácidas, lo que resulta un obstáculo, ya que el cambio del pH de las aguas residuales no es recomendable previo a su liberación al medio ambiente por la posibilidad de reacciones secundarias. Además, los materiales adsorbentes no son selectivos o específicos para la retención de GP, lo que compromete la eficiencia para remover este herbicida, ya que compite con otros contaminantes en mayor concentración presentes en el agua. Finalmente, es importante mencionar que luego de la eliminación del GP del agua, el herbicida queda retenido en la matriz adsorbente, por lo que es necesario disponer de ese sólido de alguna manera segura con el ambiente. Esto además implica que, en general, sea difícil la regeneración y reutilización de los materiales adsorbentes.
Procesos de oxidación avanzada (POA)
Las técnicas de oxidación avanzada, como la oxidación basada en fotólisis, la oxidación basada en Fenton, la oxidación electroquímica y la oxidación por ozonización, son efectivas para la degradación del GP, y si bien en comparación a la adsorción o los tratamientos biológicos podrían remover el herbicida en menor tiempo, algunos inconvenientes limitan su aplicación. En general, los POA son aplicables en aguas con baja concentración de GP. En particular, la oxidación basada en fotólisis parece ser efectiva para la degradación del GP en aguas residuales con concentraciones de GP por debajo de 50 mg L-1, pero la remoción de los catalizadores y las complicaciones para controlar las condiciones de reacción dificultan su utilización. En este tipo de oxidación, la baja penetración de los rayos UV en cuerpos de agua es la principal limitante para su aplicación. Por su parte, la oxidación basada en Fenton es un método simple y eficaz para degradar el GP en concentraciones por debajo de 258 mg L-1, pero genera lodos contaminados que requieren un tratamiento adicional. Además, su utilización implica la necesidad de acidificar las aguas residuales. La degradación del GP mediante oxidación electroquímica puede estar limitada por una baja tasa de transferencia de masa en el proceso que, sumada a un alto consumo de energía, resulta en una baja eficiencia del proceso. Además, este método se ve limitado por la corta vida útil de los electrodos. En cuanto a la oxidación por ozonización, si bien puede ser un proceso de corto tiempo de reacción, también podría generar subproductos nocivos, y su aplicación se ve limitada por la transferencia de masa de O3.
Cabe mencionar que una de las grandes limitaciones de la degradación de GP mediante los POA es que no permiten obtener una mineralización completa del GP, lo que genera varios intermediarios como el AMPA, que no permiten desechar las aguas residuales tratadas de manera segura en el medio ambiente, por presentar nuevos contaminantes.
Procesos biológicos: biorremediación
Una alternativa a los procesos físicoquímicos para la remediación de sistemas contaminados con GP consiste en la biorremediación, en la que se utilizan agentes biológicos como bacterias, levaduras u hongos (Dangi et al., 2019). Estos microorganismos son generalmente aislados de diferentes ambientes contaminados por su capacidad de degradar el GP de forma cometabólica o utilizándolo como fuente de P, C o N. Entre ellos pueden citarse a Achromobacter sp., Pseudomonas sp. 4ASW, Arthrobacter sp. GLP-1, Geobacillus caldoxylosilyticus y Pseudomonas sp. PG2982 (Singh et al., 2020; Zhang et al., 2022). Estos agentes biológicos constituyen el principio activo de distintos sistemas o procesos de biorremediación. La mayoría de los sistemas biológicos reportados para el tratamiento de ambientes contaminados con GP consisten en sistemas tipo batch que incluyen el uso de células enteras vivas. En particular en Argentina, según las recomendaciones de “Buenas prácticas agrícolas” dictadas por la Cámara de Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes (CASAFE), se propone el uso de camas biológicas como herramienta para el tratamiento de aguas de lavado, de productos obsoletos y excedentes de agroquímicos (Casafe, 2015). Estos sistemas están conformados por mezclas de microorganismos que degradan los fitosanitarios, pero requieren de períodos extensos –de aproximadamente un año– para la eliminación completa de estos agroquímicos (Elorza & Casafe, 2020). Hasta el momento se han descripto este tipo de sistemas de degradación de GP, conocidos como sistemas en growing, en los que su operación ocurre en simultáneo con el crecimiento de los microorganismos. En otras palabras, estos sistemas requieren que los microorganismos involucrados en el proceso estén metabólicamente activos. Si bien este tipo de tratamiento biológico en growing consiste en una tecnología de bajo costo y ecológica para el tratamiento de sistemas contaminados con GP, resulta ineficiente su aplicación para tratar aguas residuales de la agroindustria contaminadas con GP por diversas razones. Entre ellas se pueden enumerar: la existencia de otros componentes que podrían resultar tóxicos para el consorcio de microorganismos; las necesidades de suministro continuo de inóculo fresco y de aireación; los requerimientos nutricionales, etc. Esto disminuye la simplicidad y eficiencia del sistema para que el biocatalizador remueva el contaminante (Aswathi et al., 2019; Dangi et al., 2019; Megharaj et al., 2011). Además, estos procesos en growing requieren largos tiempos de residencia para la degradación completa del GP y puede implicar la necesidad de adicionar pasos de pretratamiento para reducir la toxicidad de las aguas residuales sobre los microorganismos. Estas limitaciones han impulsado el uso de sistemas libres de células o enzimas aisladas como agentes de biorremediación –conocidos como sistemas en resting–, una alternativa que ofrece varias ventajas. En primer lugar, las enzimas aisladas actúan con mayor especificidad que los organismos parentales, su actividad puede estandarizarse y son más fáciles de manipular. Por otra parte, las enzimas son capaces de actuar en presencia de altas concentraciones de compuestos tóxicos y amplios rangos de pH, temperatura, fuerza iónica, potencial redox y presencia de solventes orgánicos (Torres et al., 2003). En este marco, se han identificado y caracterizado diferentes tipos de enzimas con la capacidad de degradar pesticidas OPs entre las que se incluyen fosfotriesterasas, organofósforo hidrolasas, paraoxonasas séricas, metil paratión hidrolasas, diisopropilfluorofosfato fluorohidrolasa, proliasas/organofosfato anhidrasas ácidas, fosfotriesterasas similares a las lactonasas (PLLs), C-P liasas y las GP oxidoreductasas (Afriat et al., 2006; Zhang et al., 2022). Sin embargo, aún no se cuenta con productos enzimáticos comercialmente disponibles específicamente desarrollados para su aplicación en la biorremediación de ambientes contaminados con GP. El desafío actual es, entonces, la búsqueda, producción y aplicación de enzimas aisladas para el desarrollo de sistemas en resting que permitan la biorremediación de ambientes contaminados con GP, y que sean activos en las condiciones que pueden encontrarse en sistemas agrícolas.
Enzimas para la biorremediación de glifosato
El empleo de enzimas en reemplazo de los tratamientos químicos convencionales permite llevar a cabo procesos más seguros, con alta especificidad y menor consumo energético, lo que da como resultado procesos más eficientes y con un menor impacto ambiental (Wohlgemuth, 2010). Con respecto a otros tipos de tratamientos, el uso de enzimas aisladas presenta una serie de características específicas –ventajas y desventajas– entre las que se pueden enumerar: (i) su eficiencia, ya que permiten incrementar las velocidades de reacción en un factor de 108-1010 respecto a las reacciones no catalizadas; (ii) su ecocompatibilidad, ya que por tratarse de proteínas, son completamente biodegradables; (iii) las condiciones mesófilas en las que reaccionan, respecto a temperatura, pH y presión. Si bien estas condiciones constituyen una ventaja en general, cabe destacar que las enzimas requieren parámetros operacionales muy estrechos. Es decir, la posibilidad de realizar modificaciones en alguna variable de las condiciones de reacción está sujeta al rango de estabilidad operacional de las enzimas utilizadas. En ese sentido, si se pretende incrementar la temperatura para favorecer la velocidad de la reacción, se debe considerar el rango de termoestabilidad de la enzima, ya que puede llevar a su desactivación y consecuente pérdida de actividad. Asimismo, las enzimas suelen presentar su mayor actividad en medios acuosos. En ocasiones es deseable llevar a cabo reacciones en solventes orgánicos, debido a la solubilidad de los sustratos o bien por favorecer los procesos de purificación (ya que disponer de un sistema heterogéneo permite separar la enzima del medio de reacción), pero el costo de esta condición de reacción es la disminución de la actividad catalítica; (iv) su “promiscuidad”, es decir, las enzimas pueden ser activas sobre distintos sustratos. Esta versatilidad les permite generar diversos productos, dependiendo del sustrato sobre el que actúen; (v) son compatibles entre sí, lo que permite llevar a cabo reacciones en cascada o one-pot (en un mismo recipiente), lo que posibilita el desarrollo de sistemas multienzimáticos. Esto simplifica los procesos biocatalíticos ya que evita la necesidad de aislamiento de intermediarios inestables; (vi) las enzimas son regio, quimio y estereoselectivas, pero también son producidas en la naturaleza como un solo enantiómero: dado que los aminoácidos que componen a las proteínas solo existen en la naturaleza en la configuración “L”, solo se podrán formar productos quirales desde dicha enantioselectividad; (vii) las enzimas pueden requerir de cofactores. Las reacciones de oxidorreducción requieren de cofactores para que la transferencia de electrones al sustrato tenga lugar, que deben ser regenerados in situ. Estos en general no pueden ser agregados como reactivos en sus concentraciones estequiométricas por su elevado costo. Asimismo, muchas enzimas son altamente afines a sus cofactores naturales, y no permiten sustituciones sintéticas. Una solución a esta problemática es la utilización de células enteras como biocatalizadores, aprovechando la maquinaria de regeneración de cofactores propia del microorganismo; (viii) las enzimas pueden sufrir procesos de inhibición, por sustrato o producto. Como consecuencia, puede ocurrir una caída de la velocidad de reacción ante concentraciones elevadas de alguno de ellos. Estos efectos pueden ser sorteados manteniendo una concentración mínima de sustrato, o bien retirando constantemente el producto de la mezcla de reacción.
En síntesis, la alternativa de usar enzimas para los procesos de biorremediación resulta interesante considerando las características anteriormente expuestas. Como se indicó anteriormente, se han reportado algunas enzimas con la capacidad de degradar OPs. Aunque estas enzimas se han agrupado según su capacidad catalítica, es interesante mencionar que como los OPs son compuestos sintéticos, se cree que la mayoría de estas enzimas han evolucionado presentando actividad promiscua, lo cual le confiere una ventaja al microorganismo de origen y permite así la divergencia hacia nuevas enzimas (Afriat et al., 2006). Esto lleva a la idea de continuar en la búsqueda, identificación, caracterización y aplicación de nuevos biocatalizadores que permitan la biorremediación eficiente de sistemas contaminados con estos agroquímicos.
Para llevarlo a cabo es fundamental conocer y entender el mecanismo por el cual estas reacciones pueden ocurrir, por lo que a continuación se presentarán los mecanismos de degradación del GP descriptos hasta este momento.
Mecanismos de degradación microbiana de glifosato
Se han identificado y caracterizado diferentes microorganismos capaces de metabolizar GP y las principales enzimas involucradas en ello. En particular, la biodegradación de GP ha sido detectada en su mayoría por hongos y bacterias, aislados de sitios donde la aplicación del herbicida es intensa, como lo son los suelos agrícolas. Sobre la base de estudios de marcación con 14C se han dilucidado dos vías de degradación microbiana de GP (figura 3) (Zhan et al., 2018). La primera y principal, conocida como la vía del ácido aminometilfosfónico (AMPA), se corresponde con la escisión del enlace C-N por acción de la enzima GP oxidoreductasa (GOX, EC 1.5.3.23) para formar AMPA y ácido glioxílico (Villamar-Ayala et al., 2019). Para la mayoría de los microorganismos estudiados, tales como Achromobacter sp. LW9, Agrobacterium radiobacter SW9, Flavobacterium sp. GD1 y Ochrobactrum sp. GDOS (Balthazor & Hallas, 1986; Ermakova et al., 2017; McAuliffe et al., 1990), el glioxilato formado ingresa en el ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA) (Sviridov et al., 2015). Por su parte, una vez generado, el AMPA sigue tres caminos posibles: (i) continúa su degradación al ser sustrato de la enzima C-P liasa hasta dar metilamina y fosfato inorgánico (Pipke et al., 1987; Pipke & Amrhein, 1988); (ii) es metabolizado a fosfonoformaldehído por una transaminasa, que posteriormente se cataboliza a formaldehído y fosfato inorgánico a través de la fosfonoacetaldehído hidrolasa (Sviridov et al., 2012, 2015); (iii) puede ser excretado al medio ambiente y desde allí ser degradado por otras vías catalíticas (Jacob et al., 1988).
La segunda es la vía de sarcosina (SARC), en la que el GP es clivado en su unión C-P bajo la acción catalítica de la C-P liasa (EC 4.7.1.1), lo que da como resultado la producción de SARC y fosfato inorgánico (Firdous et al., 2018). Desde allí, la SARC es utilizada por microorganismos (degradadores y no degradadores de GP) como fuente de carbono y nitrógeno para su crecimiento, al ser degradada a formaldehído y glicina mediante la actividad de la enzima sarcosina oxidasa (Kishore & Jacob, 1987). A su vez, el formaldehído puede ingresar al ciclo del tetrahidrofolato, para alcanzar finalmente su mineralización completa a NH4+ y CO2 (Borggaard & Gimsing, 2008). Entre los microorganismos más estudiados en la degradación de GP por esta vía es posible mencionar a Arthrobacter sp. GLP-1, Agrobacterium tumefaciens CNI28, Alcaligenes sp. GL, Pseudomonas sp. PG2982, Streptomyces sp. StC, entre otros (Y. Chen et al., 2022; Feng et al., 2020). Asimismo, se ha visto que en ciertos casos coexisten enzimas de ambas rutas de degradación: Bacillus cereus CB4, Ochrobacterium anthropic GPK3 y Pseudomonas sp. LBr (Fan et al., 2012; Jacob et al., 1988; Sviridov et al., 2012).
Figura 3. Vías microbianas de degradación de glifosato
(AMPA: acido aminometilfosfónico)
Búsqueda, caracterización, producción y aplicación de biocatalizadores para degradar GP
Durante los últimos años, en la Universidad Nacional de Quilmes, integrantes del grupo de investigación del Laboratorio de Bioprocesos Enzimáticos (BioEnLAB) han combinado adecuadamente herramientas biotecnológicas para el desarrollo de sistemas enzimáticos específicamente diseñados para su aplicación en la degradación de GP, con la consecuente biorremediación de sistemas contaminados con este agrotóxico. Para este propósito, se han abordado distintas estrategias, como el aislamiento, caracterización, producción y aplicación de microorganismos con la capacidad de degradar OPs y las enzimas implicadas en estos procesos (Santillan et al., 2016; Santillan, Muzlera et al., 2020; Santillan, Rojas et al., 2020; Santillan et al., 2022). A continuación, se describirán brevemente algunas de las alternativas de biocatalizadores que pueden ser utilizados en procesos de biorremediación de sistemas contaminados con GP. Estas enzimas pueden obtenerse de distintos tipos de microorganismos, bacterias u hongos filamentosos. Además, su producción puede ser utilizando los microorganismos parentales silvestres o bien mediante la combinación de técnicas de bioprospección de enzimas con herramientas de ingeniería genética, que llevan a la producción de enzimas recombinantes con la capacidad de degradar GP. Esto último permite la obtención de sistemas de producción de enzimas en cantidades suficientes para considerar su aplicación en aguas e insumos del agro contaminados con estos agroquímicos.
Enzimas bacterianas
Enzimas silvestres
Con el objetivo de hallar microorganismos eficientes en la degradación de agroquímicos, se llevó a cabo una bioprospección inicial de bacterias silvestres, provenientes de un cepario o aisladas de suelo agrícola, con la capacidad de degradar pesticidas OPs. Se hallaron microorganismos de los géneros Arthrobacter, Nocardias, Streptomyces y Brevundimonas (Santillan, Muzlera et al., 2020). Estos biocatalizadores se estudiaron en cuanto a las condiciones de reacción (pH: 7-10, temperatura: 30-60° C y sustratos: metil paraoxón, paraoxón, metil paratión, coroxón, cumafós, diclorvós y clorpirifós) y diferentes formas de biocatalizador (célula entera, fracción de membrana). Entre estos biocatalizadores, se destacó una bacteria aislada de suelo con alta eficiencia en la degradación de clorpirifós, por lo que este biocatalizador se aplicó en el diseño de un biorreactor para el tratamiento de aguas contaminadas (Santillan et al., 2022). En este marco, considerando el amplio uso de GP en Argentina, junto con la experiencia y el potencial de los resultados anteriormente obtenidos para la degradación de distintos OPs, se decidió aplicar estos hallazgos a la biorremediación de sistemas contaminados con dicho herbicida. De este modo, los microorganismos bacterianos previamente seleccionados fueron evaluados en términos de su capacidad de utilizar GP como única fuente de carbono (es decir, biodegradación en growing), lo que permitió hallar específicamente bacterias capaces de emplear dicho herbicida como tal. Estos biocatalizadores presentaron la capacidad de degradar GP, y alcanzaron tasas de degradación superiores a las reportadas hasta el momento. Los resultados obtenidos fueron prometedores para avanzar en la producción de sistemas aplicables a la biorremediación de ambientes contaminados con GP, generados por el modelo agrícola actual en el que el uso de GP es intensivo. A su vez, estos biocatalizadores fueron evaluados para la biodegradación del herbicida en sistemas en resting, dispuestos en distintas formas de aplicación (sistemas de enzimas libres y sistemas de enzimas inmovilizadas), lo que resultó en el hallazgo de novedosos biocatalizadores con esta capacidad. Estos resultados representan los primeros reportes de microorganismos silvestres, autóctonos estudiados para la degradación de GP en sistemas en growing y resting. Además, es importante mencionar que, para cada etapa del desarrollo de estos biocatalizadores, fue necesario evaluar la concentración de GP remanente y sus metabolitos de degradación en los distintos sistemas ensayados de manera rápida, sensible y eficiente. Por lo tanto, fue parte fundamental de este desarrollo la puesta a punto de metodologías de derivatización, detección y cuantificación de GP y sus metabolitos de degradación por distintas metodologías analíticas, tales como la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) y cromatografía gaseosa (CG). En este punto, es remarcable el desarrollo de una estrategia para la detección de sarcosina, que –aunque es uno de los posibles metabolitos de degradación– es una metodología poco reportada y estudiada.
Los avances obtenidos en términos de biodegradación de GP en conjunto con el desarrollo de metodologías analíticas de detección y cuantificación logradas en este trabajo sientan las bases para el desarrollo de un sistema enzimático aplicable a la remoción de GP en aguas contaminadas –entre otros pesticidas– y altamente competitivo en relación con los métodos actualmente empleados.
Enzimas recombinantes
Se han reportado diversas enzimas implicadas en la degradación de OPs provenientes de distintos organismos, desde bacterias hasta mamíferos (Manco et al., 2018). Entre las enzimas mejor caracterizadas se incluyen fosfotriesterasas (PTE), organofósforo hidrolasas (OPH), paraoxonasas séricas, metil paratión hidrolasas (MPH), proliasas/organofosfato anhidrasas ácidas, carboxilesterasas (CXE), C-P liasas y las GP oxidorreductasas (GOX) (Thakur et al., 2019). En particular, el grupo de investigación del BioEnLAB ha aislado, estudiado y caracterizado diferentes microorganismos con la capacidad de degradar OPs (Santillan, Muzlera et al., 2020; Santillan et al., 2016, 2022; Santillan, Rojas et al., 2020). Considerando el potencial de los resultados obtenidos y las ventajas que representa contar con enzimas recombinantes para satisfacer su potencial demanda de aplicación, se comenzó un camino para el estudio, producción y caracterización de las enzimas de los microorganismos más prometedores para la biorremediación de sistemas contaminados con GP. En este sentido, a partir de la información de los genomas de los microorganismos implicados, y mediante diversos análisis bioinformáticos, se seleccionaron genes potencialmente codificantes para enzimas degradadoras de OPs. Estos genes se clonaron y expresaron exitosamente en distintos sistemas heterólogos, tales como E. coli y Pichia pastoris. De esta manera, la combinación adecuada de herramientas biotecnológicas permitió el desarrollo de un proceso de obtención de un biocatalizador sumamente eficiente en la degradación de OPs, potencialmente aplicable en la biorremediación de aguas contaminadas con GP.
Enzimas fúngicas
Si bien las enzimas bacterianas para la degradación de OPs son las más estudiadas, estas suelen estar asociadas a la membrana celular y son activas en condiciones alcalinas. En este sentido, y considerando la eficiencia de los microorganismos fúngicos para la secreción de enzimas extracelulares y estables en condiciones de pH fuera del rango mesófilo, en el grupo de investigación del BioEnLAB se han explorado hongos como fuente de enzimas degradadoras de OPs. Para ello, se llevó a cabo un screening en growing empleando un OP como fuente de carbono, metil paraoxón, sustrato modelo de referencia para esta actividad enzimática. Se seleccionaron hongos del género Penicillium, Aspergillus y Fusarium con la capacidad de degradar este sustrato en condiciones ácidas de reacción. Estos resultados llevaron a la producción y formulación de un extracto enzimático estable y de fácil almacenamiento. Este producto obtenido fue caracterizado en términos de estabilidad, parámetros cinéticos e influencia del pH y temperatura, y se comprobó su potencial aplicación al tratamiento de frutas y verduras. Para ello, se estudió el tratamiento de manzanas contaminadas con metil paraoxon, que logró descontaminarlas completamente en 24 h (Santillan et al., 2022). Dadas las características de este sistema, su aplicación podría extenderse a otros sistemas contaminados, y así constituir una potencial solución al problema que genera el uso intensivo de agroquímicos. En este contexto, si bien se han estudiado y desarrollado biocatalizadores capaces de degradar diferentes OPs, es sumamente importante continuar abordando el desarrollo de biocatalizadores eficientes y robustos en el tratamiento de diferentes sistemas contaminados con los OPs más empleados y contaminantes de nuestro país, como el GP.
En resumen, la línea de investigación del BioEnLAB desarrolla una plataforma de biocatalizadores robustos y potencialmente aplicables en el tratamiento de aguas residuales agrícolas contaminadas con GP –y otros OPs– que no dependen del crecimiento microbiano y resultan en una alternativa a los tratamientos existentes. Asimismo es destacable que, entre la bibliografía de la temática hasta el momento, se trata de los biocatalizadores más eficientes desarrollados. Se espera, de esta manera, que los desarrollos propuestos contribuyan a la problemática ambiental y sanitaria asociada al uso de este agroquímico, aportando una herramienta de origen nacional y económicamente viable para este fin.
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