Claudio Bisioli

Pensar que nuestros actos sobre los embriones carecen de algún efecto deletéreo es un error de concepto que a menudo se repite. Pool et al. (2012) calcularon en 200 los factores presentes en un laboratorio de fecundación in vitro (FIV) que modifican o alteran el normal desarrollo de los embriones en cultivo. Mantener un embrión en cultivo hasta el día 5 o 6, biopsiarlo, congelarlo y descongelarlo para su ulterior transferencia, entonces, debe hacerse con las mejores herramientas, cuidados y conocimientos con que contemos (Pool y Fauser, 2018; Cairo 2018 Consensus Group, 2020).

Wells et al. (2016) y Munné et al. (2017) fueron los primeros en observar diferencias en los porcentajes de aneuploidía y mosaicismo entre distintos laboratorios de FIV y de diagnóstico genético, sugiriendo que esas diferencias podían deberse a las características particulares inherentes a cada lugar. Swain (2019) alertó acerca de que ese efecto o influencia sobre la aneuploidía embrionaria o el mosaicismo no sólo podía provenir de lo que se conoce como el “sistema de cultivo” (o sea, todo: medios de cultivo, pH, temperatura, nivel de oxígeno, osmolalidad, material plástico, instalaciones, edificación, lugar geográfico, etc.), sino de los mismos procedimientos y técnicas utilizadas. Factores como la técnica de biopsia y la manipulación de las células podrían impactar en la integridad del ADN. Según este autor, los factores que podrían afectar la calidad del ADN y posiblemente la fidelidad de los resultados de un PGT-A serían los siguientes:

• el método utilizado para obtener las células del trofectodermo,
• el número de células biopsiadas,
• el sitio del blastocisto donde se obtuvieron esas células,
• el rigor con que se lavaron estas células antes de ser puestas en los tubos eppendorf,
• la posible contaminación con ADN extraño,
• el tiempo y temperatura entre la biopsia y la carga para su envío (tubing),
• el tiempo hasta el envío al laboratorio de genética y
• las condiciones del traslado al laboratorio de genética.

La influencia del laboratorio de genética donde estas células van a ser enviadas para su estudio no debe ser subestimada, ya que diferentes laboratorios usan diferentes métodos de carga de biopsias y análisis, diferentes plataformas y umbrales, métodos más manuales o automatizados, uso o no de inteligencia artificial, etc.

Las biopsias de embriones en día 3 no sólo no eran eficaces debido a la precisión limitada del FISH (tanto por la dificultad inherente de leer colores de fluorescencia en un microscopio como por el restringido número de cromosomas que permitía analizar), sino también por el número tan limitado de células disponibles para su estudio (una o a lo sumo dos). En el día 3, además, los embriones se encuentran en su pico máximo de anormalidad cromosómica y de mosaicismo. Más aún, esta etapa del desarrollo es especialmente susceptible al daño que puede causar una biopsia (Scott et al., 2013a). Adler et al. (2014) encontraron una mayor proporción de embriones euploides cuando biopsiaban blastocistos, antes que embriones de día 3, obteniendo además mejores tasas de implantación.

La introducción del láser en el mundo de la micromanipulación de gametos y embriones (Tadir et al., 1993; Joris et al., 2003; Makrakis et al., 2006) disminuyó sensiblemente el riesgo que significaba la emisión de la solución ácida de Tyrode, cuya dispersión en el entorno del embrión era muy difícil de controlar. Debe considerarse, sin embargo, que el láser tampoco es inocuo, como ya hemos sugerido al generalizar nuestra advertencia al inicio de este capítulo.

El láser utiliza energía en forma de luz y se define por sus propiedades: su potencia, el rango de longitud de onda en que opera y la intensidad de su pulso. La potencia de un láser se mide en milivoltios (mW) y se maneja en un rango entre los 20 y 400 mW, lo que varía dependiendo de la marca y modelo del láser. Cuando la potencia del láser aumenta, el diámetro del hueco en la zona pelúcida (ZP) también aumenta, y viceversa. El láser actúa en la zona infrarroja (invisible) del espectro de la luz, a 1.450 nanómetros. La intensidad del pulso de láser se refiere al tiempo de contacto con el embrión, con rangos que van desde los 20 microsegundos (µs) hasta los 1.000 µs. Cuando la luz del láser entra en contacto con el medio de cultivo en donde se encuentra el embrión, el calor se disipa y se transfiere hacia el medio acuoso, generándose gradientes de temperatura en ese medio, que se calcula van desde los 50°C hasta los 140°C, con consecuencias negativas para el futuro desarrollo del embrión. Un láser con alta potencia y baja intensidad de pulso produce menos gradientes de temperatura que un láser con menos potencia y más longitud de pulso. En general se recomienda una potencia de alrededor de 100% y un pulso de alrededor de 400 microsegundos para que el halo de calor que produce el láser no se extienda mucho más allá de la porción de zona pelúcida que se quiera horadar, sin comprometer las células vecinas. Pulsos de 1.000 µs que a veces aparecen en internet deben tomarse con precaución ya que se trata de imágenes propagandísticas donde se busca producir el efecto de que se logra una biopsia sin dificultad alguna, lo cual no siempre es posible. Por este mismo motivo es que se recomienda no utilizar la estrategia que se conoce como de “multipulso” (es decir, la herramienta que permite marcar el inicio y el fin del camino del láser para ejecutarlo en un solo disparo) sino efectuar disparos únicos según se necesiten.

Los blastocistos son todos distintos y el grado de dificultad al biopsiarlos depende de la calidad intrínseca de cada blastocisto, si son de día 5 o día 6, si son descongelados o no, etc. En general, blastocistos de día 6 o 7 o descongelados presentan más dificultades al biopsiarlos porque sus uniones celulares se han “endurecido”, resultando más difícil separar el material biopsiado con pocos pulsos de láser.

No vamos a hacer hincapié en este capítulo acerca de la obviedad de que las condiciones generales del laboratorio deben ser las óptimas, condiciones que deben asegurarnos tener la mejor cantidad y calidad de blastocistos para biopsiar y un protocolo de vitrificación y descongelación que esté funcionando con óptimos resultados (ESHRE PGT Consortium Steering Committee, 2020; ESHRE PGT Consortium and SIG-Embryology Biopsy Working Group, 2020).

Sí, en cambio, vamos a insistir en algunas condiciones no tan exploradas, como por ejemplo que el medio de biopsia debe ser el mejor. Los medios que poseen MOPS son un excelente buffer para muchos sistemas biológicos para funcionar a pH casi neutro, más suave en su acción que los buffers a base de HEPES y sin dudas preferible al PBS, el cual tiende a precipitar cationes (ej., Ca2+), puede ser inhibidor de varios sistemas, dañar funciones celulares, comprometer la actividad metabólica de gametos y embriones, desorganizar la distribución de organelas e interferir con la homeostasis iónica intracelular, incluido el pH.

El concepto clave es el siguiente: sería discutible si en algún paso de todo el proceso de FIV se puede ahorrar en algo (por ejemplo, utilizar PBS en lugar de HEPES en las punciones foliculares). Esa discusión no puede tener ningún lugar en la biopsia embrionaria (sin embargo, también dudo que pueda tener lugar en otros eslabones de la cadena de la FIV) ya que el estrés producido debe ser contrarrestado por las mejores condiciones: el mejor buffer, la mejor platina térmica, el mejor aceite. Una opción muy interesante para preservar esas condiciones óptimas es contar con equipos de flujo laminar que cuentan con campanas de cultivo incorporadas, o mini incubadoras de mesada, lo que permite eliminar los tiempos de traslado desde las incubadoras de cultivo general hasta los sitios de biopsia y tubing. Antes del tubing no se deben dejar las muestras sobre platinas calientes, porque puede llevar a la degradación del ADN. Luego se almacenarán a -20°C hasta ser enviadas a los laboratorios de genética. Ese tiempo de almacenaje está en discusión, pero en general se recomienda no extenderlo demasiado y en lo posible limitarlo a 1-3 meses.

Tan importante como las condiciones de cultivo, biopsia, tubing y envío de muestras es la manera en que se identifican correctamente los embriones de cada paciente. Es fundamental contar con un protocolo estricto de identificación y de testigos en cada paso, desde que se biopsia un embrión y entonces se le adjudica un código de letras y números, hasta que se transfiere. Una vez que se retiran los embriones de la cápsula de cultivo para ser biopsiados (si se han cultivado en grupo o sin individualizar) pasan a tener una identificación única que en general consiste en las iniciales de la paciente y un número consecutivo. Los pasos en que se pueden cometer errores de identificación son los siguientes:

• Luego de biopsiado, cuando se pasa a la cápsula de cultivo hasta su criopreservación.
• Cuando se guardan las biopsias en los tubos eppendorf.
• Cuando se elige un código de identificación que ya fue utilizado recientemente.
• Cuando se repiten números debido a ciclos consecutivos en corto tiempo o prácticas de duo stim.
• Cuando se ubican en un soporte de vitrificación.
• Cuando se descongelan.
• Cuando se transfieren a la receptora.
• Cuando se descartan los embriones aneuploides.

Cada paso de este proceso debe ser realizado bajo la supervisión de un testigo, ya sea otro embriólogo o mediante un sistema automatizado.

Uno esperaría que la eclosión de un blastocisto se produzca naturalmente en el día 5 o 6, pero nadie hace una biopsia de piel esperando que se descame naturalmente. La analogía es válida, ya que no se puede esperar a que un blastocisto extruya naturalmente, primero porque puede no ocurrir y segundo porque los laboratorios tienen tiempos que cumplir. Hay dos estrategias de biopsiado: una es practicar el orificio en día 3 o día 4. Eso hace que el embrión extruya más tempranamente, sin estar completamente expandido, ya que al crecer encuentra ese orificio y eclosiona por allí. La otra estrategia es esperar a que esté bien expandido y entonces recién allí practicarle el orificio. La segunda estrategia es la más apropiada ya que la expansión va acompañada de un mayor número de células. Entonces se biopsian células más pequeñas y en mayor número, pero en menor número relativo al conjunto de células que constituyen el blastocisto, comprometiendo entonces aún menos la integridad de ese embrión. Biopsiar más tempranamente se opone a lo antedicho. Dejar para el día 6 un embrión que ya estaba expandido en día 5 compromete su viabilidad exponiéndolo a un cultivo extendido innecesario. Las biopsias en día 7 son muy poco frecuentes. La combinación de horadar la zona pelúcida con el láser recién cuando el blastocisto se encuentre bien expandido, junto con la práctica del flicking (es decir, separar el material biopsiado haciendo una maniobra de presión sobre la holding en lugar de estirar hasta que se corte –pulling-), hace que se necesiten menos disparos y por ende se estrese menos al blastocisto.

La contaminación por células del cumulus se evita desnudando esmeradamente a los ovocitos que van a ser inyectados (ICSI) o a aquellos que fueron fecundados mediante FIV. La contaminación por espermatozoides debe importarnos solamente para los casos de PGT-M o PGT-SR, por lo cual se recomienda fecundar los ovocitos mediante ICSI. Los embriones para PGT-A pueden fecundarse mediante FIV porque el método de amplificación de ADN que se utiliza nunca llega a amplificar el densamente empaquetado ADN espermático (Lynch et al., 2022). En tal situación, y asumiendo que se emplean las plataformas tecnológicas más utilizadas, puede ser considerado aceptable realizar FIV para PGT-A, donde la contaminación con células paternas no daría lugar a la amplificación de ese ADN y no afectaría el resultado del NGS (Next Generation Sequencing). Si bien se puede decir lo mismo del PGT-SR, en general es considerado de mayor riesgo debido a su naturaleza hereditaria y, por tanto, la clínica de FIV y el laboratorio de diagnóstico genético optan por ser cautelosos y continuar usando ICSI. Con PGT-M el método de amplificación y estudio es diferente, y entonces es probable que la contaminación produzca amplificación e impacte en los resultados, y si bien esto puede detectarse, el alto impacto de cualquier diagnóstico erróneo indica que el uso de la ICSI en estos casos es obligatorio.

La descongelación, re-biopsia y revitrificación en los casos en que el resultado del estudio genético es no informativo o no concluyente tampoco es gratuito: se sabe que estos procedimientos disminuyen la viabilidad embrionaria y las tasas de éxito de la FIV (Wang et al., 2023).

La primera ley de Murphy (Matthews, 1995) expresa que, si algo puede salir mal, saldrá mal. La forma de eludir esta aparente irrevocabilidad de Murphy es contar con un sistema integral de cultivo y biopsia embrionaria óptimo y con los protocolos de verificación y trazabilidad más confiables y estrictos posible.

Agradecimientos

Soledad Sepúlveda fue una maestra inolvidable. Los conceptos que vierto sobre el láser le pertenecen en su mayoría. Ariel Ahumada fue pionero en nuestro medio en el uso del láser y generoso al invitarme a ver su funcionamiento. Monique Bueno nos enseñó recientemente las formas más modernas y apropiadas de biopsiar sin comprometer el ulterior desarrollo de un blastocisto. En Pregna Medicina Reproductiva Laura Kopcow, Mercedes Papayannis, Evelyn De Martino, Paula Filardi, Mauro Chiarello, Laura Magri, Victoria Soberón, Cecilia Figueroa, Carolina Lombardi, Sol Muñoz y Daniela Mercado aseguran las mejores condiciones para nuestro programa de PGT.

Referencias

Adler, A., Lee, H-L., McCulloh, D. H., Ampeloquio, E., Clarke-Williams, M., Hodes Wertz, B., & Grifo J.. (2014). Blastocyst culture selects for euploid embryos: comparison of blastomere and trophectoderm biopsies. Reprod Biomed Online, 28, 485-91.

Cairo 2018 Consensus Group. (2020). ‘There is only one thing that is truly important in an IVF laboratory: everything’. Cairo Consensus Guidelines on IVF Culture Conditions. Reprod Biomed Online, 40, 33-60.

ESHRE PGT Consortium Steering Committee. (2020). ESHRE PGT Consortium good practice recommendations for the organization of PGT. Hum Reprod Open, 1-12.

ESHRE PGT Consortium and SIG-Embryology Biopsy Working Group. (2020). ESHRE PGT Consortium and SIG Embryology good practice recommendations for polar body and embryo biopsy for PGT. Hum Reprod Open, 1-12.

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