El hígado tiene la capacidad inigualable de volver a crecer luego de la pérdida de parte de su tejido, ya sea por lesiones tóxicas, infecciones virales o traumas. Mediante un fenómeno de hiperplasia compensatoria, el hígado recupera la masa perdida manteniendo el funcionamiento óptimo del organismo. Esta característica, conocida como regeneración hepática, permite el trasplante de hígado a partir de donantes vivos y la resección de tumores hepáticos primarios y metastásicos. Además, este proceso ayuda a explicar cómo responde el órgano frente a un daño tóxico por sobredosis de alcohol y drogas, o por infecciones como las hepatitis virales. Un mejor conocimiento de las moléculas que cooperan para iniciar, sostener y completar la regeneración hepática es necesario para la comprensión de las mencionadas situaciones clínicas en las cuales la regeneración del hígado puede fallar o ser deficiente, lo que posibilita, a su vez, establecer mejores estrategias terapéuticas.

Si bien se conocen ciertas vías que actúan en la proliferación hepática post-HP, se supone que muchas otras no conocidas también están involucradas, debido a una característica importante de este proceso que es la redundancia de las vías de señalización que participan para asegurar que se complete la regeneración. Es decir que, frente a la falta de activación de un determinado gen o proteína, otras moléculas compensatorias pueden actuar, de manera que la regeneración hepática no se ve interrumpida y sólo ocurre un retraso en la proliferación. El conocimiento de esta señalización no sólo es valioso para comprender la regeneración hepática, sino que estas vías, actuando de forma alterada, son las que también se encuentran involucradas en la proliferación incontrolada del hígado.

El papel de los canales de K+ sensibles a ATP se ha estudiado ampliamente, en especial en cardioprotección. La evidencia acumulada coincide en que esta función se basa en la apertura del canal de K-ATP mitocondrial y la inhibición de la apertura de poros de transición de permeabilidad de la membrana. La función del canal de K+ mitocondrial es regular el volumen de la mitocondria, y a su vez, se conoce que regula el transporte de electrones (Garlid AO, Jaburek M, Jacobs JP, & Garlid KD, 2013), aquí radica la importancia de este canal en la bioenergética mitocondrial.

En cuanto a la participación de los canales K-ATP en la protección frente al daño hepatocelular, son escasos los estudios realizados hasta el momento. El trabajo previo de Nakagawa y col. analizó el efecto de la apertura de los canales K-ATP mediante la administración de diazóxido en la regeneración hepática post HP. Los autores comprobaron que el diazóxido en el periodo inmediato a la HP mejora notablemente el proceso regenerativo, observando un aumento en la relación PH/PC en el grupo que recibió diazóxido (Nakagawa Y, Yoshioka M, Abe Y, Uchinami H, Ohba T, Ono K & Yamamoto Y, 2012). Los autores concluyeron que el fármaco mejora el proceso proliferativo del hígado remanente al mantener un mayor contenido de ATP en el tejido.

En otro estudio utilizando ratones Kir6.2-/-, se investigó el rol de los canales K-ATP en un modelo de injuria hepática inducida por LPS. Los autores demostraron que la ausencia de Kir6.2 exacerba la injuria hepática inducida por LPS mediante el aumento de la respuesta inflamatoria (Du R-H, Tan J, Yan N, Wang L, Qiao C, Ding J-H, & Hu G, 2014). La ausencia de Kir6.2 promovió notablemente la infiltración de linfocitos y neutrófilos en el hígado y el aumento significativo de los niveles séricos de ALT en respuesta al tratamiento con LPS.

El presente estudio proporciona, por primera vez, evidencias claras de que la proteína Kir6.2 del canal K-ATP participa en el fenómeno regenerativo luego de una HP de dos tercios en ratones.

Para llevar adelante el estudio, en primera instancia, se debió poner a punto el procedimiento de HP del 70% en ratones, ya que dicho procedimiento no había sido puesto a punto previamente en nuestro laboratorio. Nos basamos en el PQE publicado por Nevzorova y col. (2017). Tal como se presentó en la sección de Resultados, la tasa de mortalidad de los animales era muy alta, por lo cual se modificaron las dosis de los anestésicos utilizados. Primero, se probó con una reducción a la mitad de la dosis original. Si bien la reducción del 50% condujo a una disminución de la tasa de mortalidad en la cepa Kir-/-, esta baja dosis de anestésicos limitaba el tiempo de la cirugía, ya que la anestesia era de menor duración. Tras la modificación de la dosis a un 75% de la dosis inicial, se logró aumentar la sobrevida de los ratones en ambas cepas. Consideramos que la administración de ketamina/xilacina a 75 y 2,25 mg/kg PC, respectivamente, fue la concentración óptima para la realización de este procedimiento en ratones, disminuyendo la tasa de mortalidad a un 6% en la cepa knockout y a un 26% en la cepa WT. Sin embargo, las tasas de supervivencia de los ratones sometidos a HP deben ser mejoradas. En este sentido, otra publicación que presenta un método reproducible y bien tolerado de HP de dos tercios en ratones recomienda utilizar únicamente anestésicos inhalatorios como isoflurano. Los autores destacan que el uso de anestésicos inyectables como ketamina/xilacina no se recomienda debido al riesgo de anestesia insuficiente y efectos secundarios graves (Mitchell T & Willenbring H, 2014). Queda pendiente el uso del anestésico inhalatorio recomendado para nuestros futuros estudios en regeneración hepática en ratones sometidos a HP.

Una vez puesta a punto la cirugía, se estudió el índice PH/PC en los animales WT y Kir-/- a diferentes tiempos post HP. A todos los tiempos estudiados posteriores a la cirugía, el índice resultó significativamente menor en los animales carentes de la proteína Kir6.2. Se sabe que el pico máximo de síntesis de ADN luego de una HP en ratones se produce a las 48 h post cirugía. Las diferencias en el índice PH/PC desde las 48 h y en adelante serían el reflejo de una proliferación disminuida en los ratones Kir-/-. Sin embargo, el índice también está disminuido a tiempos cortos (1, 2 y 3 h) y esto no puede ser reflejo de una proliferación afectada, ya que a esos tiempos aún no hay proliferación de los hepatocitos. Hipotetizamos que esta diferencia en el índice PH/PC a tiempos cortos entre las dos cepas en estudio puede deberse a diferencias en el flujo sanguíneo que reciben los hígados regenerantes en los primeros momentos posteriores a la cirugía. Por otra parte, a las 168 h (7 días), cuando el proceso regenerativo en roedores está llegando a su fin, el índice en los ratones WT parece estar aumentado con respecto al tiempo cero del mismo grupo. Este hecho fue también comprobado en investigaciones previas. Se reportó que al séptimo día, la masa hepática regenerada superó el peso preoperatorio, previo a descender y alcanzar un valor constante al octavo día post operatorio (Andersen KJ, Knudsen AR, Kannerup AS, Sasanuma H, Nyengaard JR, Hamilton-Dutoit S, Erlandsen EJ, Jørgensen B, & Mortensen FV, 2013). Además, se ha reportado que la masa de los lóbulos remanentes del hígado se vuelve casi idéntica a la masa total original del total de los cinco lóbulos (en ratas y ratones) (Michalopoulos GK, 2006). Se ha comprobado, por otra parte, la existencia de un sistema de control de “hepatoestatos”, que asegura que el peso del hígado sea el que debería ser y no más, para el desempeño de sus funciones homeostáticas (Michalopoulos GK, 2006).

La disminución del índice PH/PC en los ratones carentes de Kir6.2 a las 48 y 96 h post HP se acompañó de una disminución de los niveles de dos proteínas clave en el proceso de proliferación hepática, PCNA y ciclina D1. La disminución en la expresión de estas proteínas se condice con la población hepatocitaria que resultó incapaz de ingresar en el ciclo celular (menor número de células PCNA-positivas determinadas por inmunohistoquímica). Estos resultados confirman que la ausencia de Kir6.2 afecta negativamente al proceso regenerativo; en los animales Kir-/-, la falta del nivel de aumento de las proteínas PCNA y ciclina D1 esperable en la regeneración hepática, pone de manifiesto el retraso en el curso normal de la respuesta regenerativa durante el proceso de recuperación de la masa hepática posterior a la hepatectomía.

Las acciones de Kir6.2 se podrían dar en diferentes engranajes de la compleja maquinaria de la regeneración. Una de las alteraciones que es esperable que se produzca es sobre el metabolismo bioenergético, que abarca la generación, transferencia y utilización del ATP. Como es bien sabido, el canal K-ATP rige el estado bioenergético basal de la célula, manteniendo una determinada concentración de ATP intracelular; este hecho es fundamental para el inicio de la respuesta proliferativa. Si bien en condiciones fisiológicas basales puede no existir una alteración apreciable entre ambas cepas, el papel del canal de potasio sensible a ATP se pone en relevancia en situaciones de alto estrés, es el caso de una HP. En los ratones de la cepa Kir6.2 fue comprobada la disminución de la masa hepática al finalizar el proceso regenerativo, regeneración que en la ausencia del canal fue incapaz de mantenerse en los niveles esperados. Esta es una de las aristas que puede ser clave para ayudar a entender la intervención del canal K-ATP en el complejo proceso de la regeneración. Para el análisis de este aspecto, queda pendiente realizar mediciones de los niveles de ATP y otros metabolitos energéticos en las diferentes condiciones estudiadas.

Para indagar sobre otros mecanismos que pueden estar participando de una regeneración hepática desfavorecida en los ratones carentes de Kir6.2, se determinó el índice apoptótico como el cociente entre la proteína proapoptótica Bax y las proteínas antiapoptóticas Bcl-2/Bcl-xL. Bax es una proteína con la habilidad de suprimir la capacidad de Bcl-2 para bloquear la apoptosis. En algunos tejidos, los patrones de expresión de Bax y Bcl-2 están regulados de forma paralela, lo cual sugiere un antagonismo activo entre ambas proteínas. Ante una señal de muerte celular, Bax se inserta en la membrana externa mitocondrial en forma de homooligómero, crea poros que permeabilizan la membrana externa mitocondrial. Durante la apoptosis, se produce a nivel mitocondrial, la apertura de canales no selectivos o poros de transición de la permeabilidad, alterándose el equilibrio de iones entre la matriz mitocondrial y el espacio entre sus membranas internas y externas, generando la pérdida del potencial transmembrana. Estos fenómenos descompensan la cadena respiratoria creando una hiperosmolaridad de la matriz lo que hace que ésta se expanda y se hinche. La membrana mitocondrial interna se adapta a la expansión disminuyendo sus repliegues, pero la capa externa acaba rompiéndose y liberando hacia el citosol proteínas activadoras de caspasas. La proteína Bcl-xL, por su parte, tiene una alta homología con Bcl-2 y una distribución celular semejante, lo que sugiere que ambas proteínas funcionan de una manera similar. Se propone que Bcl-2 y Bcl-xL se comunican funcionalmente con proteínas de la membrana interna mitocondrial, que gobiernan el transporte iónico. También regulan el pH del espacio intermembrana, produciendo un aumento de la salida de protones desde la mitocondria. Las proteínas Bcl-2 y Bcl-xL evitan la apoptosis al secuestrar a las proteínas proapoptóticas, evitando la formación de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (Edlich H, 2018).

En cuanto al índice apoptótico, los animales Kir-/- lo presentaron significativamente aumentado a las 48 h post cirugía y con una tendencia a permanecer elevado a las 96 h. Este resultado indica que la relación entre las proteínas pro y antiapoptóticas se encuentra alterada en los ratones Kir-/- y que la ausencia del canal Kir6.2/K-ATP puede relacionarse con una inducción mayor de la apoptosis en las células del tejido hepático. Por lo tanto, en los ratones carentes de Kir6.2, durante el periodo regenerativo posterior a la cirugía, no solo se ve afectada la proliferación hepatocitaria, sino que también puede verse comprometida la regeneración del tejido por una mayor tasa de apoptosis, con la consecuencia directa del retraso en la regeneración hepática.