Animales utilizados y modelo de HP

Para el desarrollo completo de este trabajo se utilizaron ratones de las cepas C57/B6 de tipo salvaje (WT, del inglés wild type), los cuales fueron utilizados como animales control, y ratones Kir6.2-/- (ratones knockout o carentes de la proteína Kir6.2), los cuales fueron utilizados para evaluar el rol de la proteína en la regeneración hepática posterior a una HP. Se trabajó con ratones macho de 8 a 14 semanas de edad. Los animales fueron mantenidos en el bioterio de la Universidad Abierta Interamericana (UAI). Se mantuvieron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y se alimentaron con comida regular para ratones. Los protocolos experimentales se realizaron de acuerdo con la guía del Instituto Nacional de la Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Publicación del NIH N°25-28, revisada en 1996) y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) de la Universidad Abierta Interamericana (UAI).

El modelo de HP del 70% en roedores fue descrito por primera vez hace 90 años atrás por Higgins y Anderson (Higgins G & Andersson R, 1931). Sin embargo, esta técnica es aún el método más utilizado por la comunidad científica que estudia la fisiología y patología de la regeneración hepática, ya que permite el análisis en profundidad de las vías de señalización involucradas en el proceso. La importancia de la HP como un método clave en la hepatología experimental ha incluso aumentado en la última década debido a la creciente disponibilidad de ratones genéticamente modificados. Es por ello que muy recientemente se ha propuesto el establecimiento de un procedimiento quirúrgico estándar (PQE) para la implementación de HP en ratones. En particular, el PQE ofrece toda la información de fondo para el desarrollo del modelo de HP y provee de una guía comprensiva para la planificación y desarrollo de experimentos en ratones sometidos a HP. Además, la guía tiene especialmente en cuenta los últimos cambios en la reglamentación para el bienestar de los animales de laboratorio de la Unión Europea, manteniendo la concordancia con la legislación internacional vigente (Nevzorova Y, Tolba R, Trautwein C, & Liedtke C, 2015). Para la realización de las cirugías, se siguió el PQE publicado por Nevzorova y col., teniéndose en cuenta las consideraciones de género, edad, anestésicos, tiempos de observación/estudio post-HP.

Al momento de la cirugía, los animales fueron anestesiados con una mezcla de ketamina (100mg/kg de peso corporal, PC) y xilacina (3 mg/kg PC), en inyección intraperitoneal. Una vez constatado que el animal estaba profundamente anestesiado (testeo de los reflejos en cola y pie), se realizó el procedimiento quirúrgico siguiendo estrictamente el PQE y sus recomendaciones. El procedimiento consistió en una laparotomía de la piel abdominal y la capa muscular. Luego, se identificaron, se ligaron y se cortaron el lóbulo lateral izquierdo y las porciones derecha e izquierda del lóbulo mediano. Posteriormente, se suturó la cavidad abdominal. Una vez finalizada la cirugía, los ratones se mantuvieron bajo supervisión permanente en un ambiente a temperatura controlada, hasta la recuperación total de la anestesia. Se monitorearon, además, los signos de dolor que indicaron la necesidad de un tratamiento analgésico. De acuerdo con la bibliografía, si el procedimiento quirúrgico es realizado correctamente, se espera que en ratones WT la tasa de mortalidad asociada a la cirugía sea menor del 5% (Nevzorova Y, Tolba R, Trautwein C, & Liedtke C, 2015).

La eutanasia de los animales fue realizada por exceso de anestesia y punción intracardíaca para exanguinación. De las muestras de sangre, se obtuvo el suero que se utilizó para las determinaciones bioquímicas. Además, se extrajeron y pesaron los hígados para ser procesados y guardados en condiciones adecuadas. Una parte del hígado se fijó en formalina neutra tamponada 10% v/v con posterior inclusión en parafina para la realización de estudios histológicos e inmunohistoquímicos y el resto se congeló en nitrógeno líquido seguido de almacenamiento en ultrafreezer (-80 °C), de manera de conservar las muestras para las determinaciones posteriores. La técnica de HP permitió obtener muestras de hígados quiescentes (el material resecado a tiempo cero) y del hígado regenerante en el tiempo de interés, ambos provenientes del mismo animal, lo que posibilitó una comparación directa entre ambos estados en un individuo.

Análisis del índice peso del hígado/peso corporal y de la masa hepática restaurada

La proporción peso hígado/peso corporal (PH/PC) se calculó como [(peso hígado/peso corporal) x 100] y se usó como una medida del volumen total de hígado que regenera a diferentes tiempos post HP (Yang C, Mowry L, Nejak-Bowen R, Okabe H, Diegel CR, Lang RA, Williams BO & Monga SP, 2014). Se estudiaron diferentes tiempos post HP: 1, 2, 3, 48, 96 y 168 h post cirugía. Los tiempos estudiados corresponden a las diferentes fases de la regeneración hepática: a) la etapa de inicio o priming incluyó los primeros momentos luego de la cirugía (0-6 h post HP) y cubrió la inducción de los factores de respuesta inmediata; b) la etapa de inicio de la fase S junto con el pico de replicación del ADN (24-48 h post HP) y c) el final de actividad del ciclo celular (96 h post HP). Para monitorear la restauración de la masa hepática regenerante, se realizaron estudios a 168 h (7 días) post HP (Besnard A, Gautherot J, Julien B, Tebbi A, Garcin I, Doignon I, Péan N, Gonzales E, Cassio D, Grosse B, Liu B, Safya H, Cauchois F, Humbert L, Rainteau D, & Tordjmann T, 2016).

Determinación de actividades de enzimas hepáticas

Se utilizaron los sueros obtenidos de los animales sometidos a HP para determinar los niveles de los marcadores de daño hepático: alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) mediante la utilización de equipos comerciales (Wiener Lab., Rosario), según las instrucciones del fabricante.

Evaluación histológica

Para analizar la organización de los hepatocitos, sus características histológicas, la presencia de congestión vascular o inflamación, las muestras de tejido hepático incluidas en parafina de bajo punto de fusión se cortaron secciones de 3-5 µm de espesor, las cuales fueron posteriormente desparafinadas, rehidratadas y teñidas con hematoxilina-eosina. Las secciones coloreadas fueron analizadas por microscopía óptica (procesamiento y análisis realizados en el Servicio de Histotecnología de la Cátedra de Morfología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario).

Estudios de immunohistoquímica

Para los estudios de immunohistoquímica incluidos en parafina, secciones hepáticas de 3 μm fueron obtenidas por corte con un micrótomo. Las mismas se desparafinaron, rehidrataron y se bloqueó la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% por 10 minutos. Luego, se procedió a la recuperación antigénica por calor en solución de citrato de sodio (pH 6). Posteriormente, se bloquearon los sitios inespecíficos con albúmina sérica bovina al 3% y las secciones se incubaron con el anticuerpo primario dirigido contra la proteína antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA, Santa Cruz Biotechnology) durante toda la noche. Finalmente, se utilizó el sistema de detección CytoScan HRP (Cell Marque), que utiliza el sistema biotina-estreptavidina, y se visualizó por la reacción con diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno con posterior contra tinción con hematoxilina.

Preparación de lisados totales hepáticos

Parte del tejido hepático obtenido de la cirugía y guardado a -80 °C fue utilizado para preparar lisados totales. Para ello, se homogeneizó una parte del tejido hepático en cuatro partes de buffer RIPA (HCl 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tritón X-100 1%, desoxicolato de sodio 1%, SDS 0,1%) conteniendo inhibidores de proteasas (Protease inhibitor cocktail, Sigma-Aldrich) y fosfatasas (1mM de Na3VO4, 1 mM de NaF). Luego de realizar una incubación de 30 min en hielo y de 3 ciclos de congelado/descongelado, las muestras se centrifugaron a 25000 g durante 30 min a 4 °C. Los sobrenadantes correspondieron a los lisados hepáticos. A través del método de Lowry (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL & Randall RJ, 1951), se determinó la concentración de proteínas en los lisados totales.

Estudios de Western Blot

Cantidades iguales de proteínas fueron sujetas a electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS al 12% P/V y transferidas a membranas de polivinildifluoruro (PVDF). Las membranas fueron bloqueadas con leche al 10% P/V, lavadas e incubadas toda la noche a 4 °C con el anticuerpo primario específico. Finalmente, luego de sucesivos lavados con buffer fosfato salino conteniendo polisorbato 20 (PBS-Tween), las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario respectivo conjugado a peroxidasa y las bandas se detectaron con un sistema de detección por quimioluminiscencia (ECL, Thermo Scientific) y se cuantificaron por densitometría usando el software Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics).

Los anticuerpos utilizados para los estudios de Western Blot fueron obtenidos de Santa Cruz Biotechnology y están dirigidos contra las siguientes proteínas: PCNA, ciclina D1, Bax, Bcl-xL y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

Análisis estadísticos

En todos los casos, los valores presentados corresponden a la media aritmética ± SEM (error estándar).

Cada grupo de animales contó con n ≥ 3 para cada tiempo estudiado. La significancia de las diferencias halladas se puso a prueba mediante un test ANOVA de un factor, seguido del test Tukey de análisis múltiple para analizar diferencias entre varios grupos. Las diferencias se consideraron significativas cuando el valor de p resultó ser menor de 0,05.